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螺旋藻是新资源食品,含有丰富的蛋白、碳水化合物、维生素、矿物质、不饱和脂肪酸、微量元素等营养素。螺旋藻中的多糖是一种天然活性物质,具有抗肿瘤、抗氧化、抗辐射、降血糖、抗病毒、改善胃肠道功能等多重功效。本课题以螺旋藻粉为原料,确定螺旋藻多糖的提取、分离纯化工艺;研究分离纯化多糖对结肠腺癌细胞(Caco-2细胞)生长的抑制作用、对预防Caco-2细胞模拟的肠道屏障氧化损伤的生物活性;对高活性多糖进行结构分析。主要研究内容及结果如下:(1)螺旋藻多糖提取工艺研究。考察反复冻融结合超声辅助热水提取螺旋藻多糖,用单因素筛选和正交试验优化提取工艺。确定最优提取工艺为:超声时间20 min,提取温度90℃,料液比1:25,提取时间1.5 h,提取次数2次,在此条件下经过验证试验,螺旋藻粗多糖的提取率为(13.17±0.49)%。(2)螺旋藻多糖去蛋白工艺研究。通过sevage法去除螺旋藻粗多糖中的蛋白质杂质,用单因素筛选和正交试验分析,得到蛋白质提取率高且多糖损失小的最佳工艺为:氯仿:正丁醇=5:1,sevage液:粗糖液=3:1,去蛋白次数6次,震荡时间25min。在此条件下经过验证试验,蛋白质去除率达(63.24±0.43)%,多糖保留率为(82.12±0.51)%,得到螺旋藻粗多糖(PSP)。(3)PSP分离纯化研究。经过最佳提取工艺和最佳去蛋白工艺后得到PSP,PSP经过超滤离心截留技术分离纯化得到三个不同的多糖组分PSP-1、PSP-2及PSP-3,PSP-3再经凝胶渗透色谱分离纯化得到PSP-3-1及PSP-3-2,其中PSP-3-1为分子量高度集中的多糖,纯度达99%以上,通过GPC检测,分子量为623.02kDa。(4)结肠腺癌细胞(Caco-2细胞)生长的抑制活性研究。用MTT法考察PSP-1、PSP-2及PSP-3三个组分对结肠腺癌细胞(Caco-2细胞)生长的抑制作用并确定最佳组分及浓度,结果表明三个组分都有一定的抑制Caco-2细胞生长的活性,但PSP-1和PSP-2对Caco-2细胞生长的抑制作用不明显且不稳定,而PSP-3的抑制作用最稳定且最明显,有量效关系,PSP-3的最佳抑制Caco-2细胞生长的浓度为5.00 mg/mL,IC50为0.632 mg/mL。(5)预防Caco-2细胞模拟的肠道屏障氧化损伤活性研究。建立Caco-2细胞模拟肠道屏障模型,考察PSP-1、PSP-2及PSP-3对Caco-2细胞模拟的肠道屏障氧化损伤的预防作用,结果表明0.1 mg/mL的PSP-3效果最佳。再考察PSP-3经过分离纯化后的产物PSP-3-1、PSP-3-2及阳性对照组谷氨酰胺对Caco-2细胞模拟屏障氧化损伤的预防作用,结果显示0.1 mg/mL的PSP-3-1效果优于谷氨酰胺对照组,说明PSP-3-1能预防Caco-2细胞模拟的肠道屏障氧化损伤。(6)PSP-3-1结构分析。经IR、GC、NMR、高碘酸氧化、AFM对PSP-3-1进行结构分析,结果表明:螺旋藻多糖PSP-3-1有明显的多糖特征红外吸收;其单糖组成及占比结果为:D-核糖:L-鼠李糖:L-阿拉伯糖:L-岩藻糖:D-葡萄糖=1:0.70:1.03:2.1:6.59;含有1→2、1→4型的糖苷键,可能含有1→3型糖苷键,几乎不含1→6糖苷键;糖链中含α、β两种糖苷构型,以β构型为主,含有氨基,说明PSP-3-1是含蛋白质的多糖缀合物;有支链或直链两种存在形式,溶度升高时,自发聚集成网状结构,其中直链多糖分子的宽度为34.132 nm,高度为819.169 pm。