论文部分内容阅读
目的糖尿病创面是临床常见的一种慢性难愈性创面。好发于患者肢体的末端,尤其是肢体的承重部位。目前,糖尿病创面已经成为非外伤性截肢最常见的原因。导致这种严重并发症的主要原因是周围血管、神经的病变,合并内源性生长因子的低水平表达以及持续的机会感染。近年来,细胞治疗已被视为组织再生的一种有效方法。人们对干细胞(如：骨髓来源干细胞,脂肪来源干细胞及内皮祖细胞)用于糖尿病创面的治疗有着极大的兴趣。研究表明,脂肪来源干细胞不仅可以增加缺血性皮瓣的血流灌注,还能够有效地促进创而愈合。然而,干细胞的体外扩增至少需要2-3周的时间,这不仅增加了细胞污染的几率,同时增加了细胞分化的可能。此外,由于实验的设施和技术必须通过食品药品管理局(FDA)的批准,这可能会阻碍临床医师们以实验研究为目的的细胞培养。来源于脂肪组织的基质血管分(SVF)是一种包含脂肪来源干细胞、内皮祖细胞、造血干细胞、抗炎细胞、T细胞的混合细胞成分。SVF广泛地存在于脂肪组织中,相对容易获取,不会对供区部位造成太大的损伤,同时避免了细胞培养,因而SVF被认为是一种促进创面愈合的良好细胞来源。众所周知,移植细胞的存活率并不高。细胞迁移和组织再生需要一个合适的微环境。胶原是细胞外基质的主要成分,占哺乳动物体内总蛋白量的30%。胶原因其弱抗原性、良好的生物相容性和生物降解性作为细胞载体或组织修复重建的一种生物活性物质复合材料而广泛应用。本研究旨在构建一个以胶原支架为基础的SVF靶向递送系统,用于促进糖尿病创面的愈合。假设通过一种暂时的生物活性基质来改善创面局部的微环境,从而增加新生血管的形成,促进糖尿病创面的愈合。方法实验材料：从小牛皮肤中提取出胶原蛋白,并使用冻干技术将其制成具有三维结构的膜片,剪成1.5cm×1.5cm大小备用。实验方法：1.6只雌性实验用猪适应性饲养一周后制备糖尿病模型。建模成功后切取颈部脂肪提取新鲜的SVF, Dil荧光标记细胞后备用,同时制备糖尿病创面模型,将所有创面随机分为A、B、C、D四组,所有实验动物术前均接受血糖及体重的监测,术后每日监测血糖；2.所用胶原膜片行扫描电镜检查,观察其三维结构及孔隙大小；3.SVF与胶原膜片分别结合5min,15min,30min,60min,120min,观察SVF与胶原膜片的结合率：4.A组(对照组)：猪糖尿病溃疡创面局部喷洒PBS溶液；B组(SVF组)：猪糖尿病溃疡创而局部喷洒SVF细胞悬液；C组(膜片组)：猪糖尿病溃疡创面局部胶原膜片(胶原膜片负载PBS)覆盖；D组(SVF-膜片组)：猪糖尿病溃疡创面局部SVF-胶原膜片(胶原膜片负载SVF细胞悬液)覆盖；5.给药后5min用无菌纱布绷带包扎固定：6.各组分别于术后第7d打开敷料观察创面并取样;7.各组于术后第7d创面拍照,计算和比较创面愈合率；8.各组于术后第7d取创面肉芽组织制成冰冻切片,荧光显微镜下观察SVF细胞存活情况；9.各组于术后第7d取创面肉芽组织行组织学观察,包括HE染色,免疫组化染色,比较各组创面肉芽组织的血管化程度；10.各组于术后第7d取创面肉芽组织用Elisa法检测创面肉芽组织中VEGF及bFGF的含量。结果1.扫描电镜观察显示该胶原膜片具有多孔疏松的三维空间立体结构,孔隙范围在20μm至200-μm之间;2.SVF与胶原膜片在结合60min后,显示更高的细胞结合率(41.11±2.3%)；3.与A组、B组及C组相比,D组创面愈合率在第7d为34.67±4.9%,显示出更高的创面愈合率(P<0.05或P<0.01);4.B组与D组均可见被Dil标记的SVF在创面肉芽组织中存活,并在荧光显微镜下发出特殊的红色荧光；5.组织学观察结果5.1HE染色观察结果,与A组、B组及C组相比,D组创面肉芽组织切片表现出更显著的血管化程度：5.2免疫组化染色结果,与A组、B组及C组相比,D组切片表现出更多的血管数目(A10.11±3.98个,B：11.50±4.36个,C：14.81±4.87个,D：20.69±5.50个,P<0.01)；6. Elisa检测创面肉芽组织中VEGF及bFGF的含量。术后第7d,D组创面肉芽组织中VEGF及bFGF的含量明显高于其余各组(VEGF A:158.75±39.25pg/ml, B:172.09±52.34pg/ml,C:215.50±43.01pg/ml,D:285.44±56.52pg/ml,P<0.05, P<0.01; bFGF A:10.12±2.46pg/ml,B:10.23±3.13pg/ml, C:12.25±2.02pg/ml, D:16.07±3.36pg/ml, P<0.05,P<0.01)结论1.SVF结合胶原膜片(SVF-膜片)能够有效地增加血管的形成及血管源性的生长因子的分泌,从而促进猪糖尿病创而的愈合；2.SVF结合胶原膜片(SVF-膜片)能够在创面局部形成较高的细胞浓度,从而发挥持久的靶向治疗作用：3.SVF不需要培养,来源广,获取时不会对供区造成太大的损伤,使得SVF-膜片支架结构成为一种靶向修复组织的简单而有效的方法。