研究背景脑出血(Intracranial hemorrhage,ICH)是一种临床上常见的卒中类型,具有高致残率和高死亡率,约占所有卒中类型的10-15%。文献中报道,脑出血发生后1个月的死亡率约为40%,过去20年内并无明显的改变。对于脑出血疾病,目前仍无确切有效的治疗方案能够显著改善患者生存率,仍仅限于初期的支持治疗,如控制血压,减缓脑水肿以及维持血流动力学的稳定。随着社会老龄化加剧,脑出血的发生率将会不断上升。因此,对于研究人员来说,进一步了解脑出血之后的相关病理生理学机制,并且发现新的治疗方案,无疑是脑出血相关研究进展中最重要的部分。目前在相关研究中,炎症在脑出血介导的脑损伤中占无比重要的地位。当出血发生后,血液成分包括红细胞、白细胞、巨噬细胞、血浆蛋白(比如凝血酶)迅速进入脑实质,随即炎症应答立即开始发生,表现为炎症细胞的活化与聚集。越来越多证据表明,炎症引起的损伤在脑出血介导的继发性损伤中占有重要地位。固有免疫的活化和炎症应答导致脑出血后炎症损伤的发生。固有免疫的活化同时导致小胶质细胞的激活、血肿周围炎症反应、血源性炎症细胞的浸润、炎症因子(如TNF-α、IL-1β)的释放以及脑水肿。炎症反应进一步加重脑出血引起的脑损伤,最终导致组织损伤、血脑屏障破坏以及大量神经细胞死亡。应用药物对脑出血引起的继发性损伤,特别是神经炎症的发生过程进行干预,是目前研究的热点所在,对于缓解脑出血后的脑损伤,改善患者神经功能,具有十分重要的意义。过氧化物酶体增殖物激活受体共激活因子1α(PGC-1α)是一种调节细胞能量代谢的转录共激活因子,高表达于棕色脂肪组织、心脏、骨骼肌、肾脏和脑。PGC-1α是氧化应激中抗氧化反应的关键调节因子,并且是线粒体发生强有力的激动剂。相关研究表明,PGC-1α因其具有抗氧化作用,在多种神经系统疾病中扮演者重要角色。在脑出血中,先前研究指出,抑制PGC-1α的表达进一步加重了脑出血引起的脑损伤,恶化神经功能。最近有学者发现,PGC-1α存在特异性活化剂ZLN005,并且在缺血诱导脑损伤模型中,通过改善线粒体功能,表现出明显的神经保护作用。PGC-1α可通过调节炎症细胞中线粒体钙离子通道相关蛋白TOM70/MICU1的表达,抑制活性氧的产生,上调抗炎相关蛋白表达,从而抑制炎症反正。因此,我们将使用注射自体血法制作出ICH的大鼠模型,探索PGC-1α在ICH引起的继发性脑损伤中的神经保护作用,以及其通过TOM70/MICU1通路对神经炎症的作用情况,为脑出血提供新的治疗方向。方法第一部分SD成年大鼠随机分为以下4组:假手术组(sham组)、脑出血组(ICH组)、脑出血+溶剂组(ICH+Vehicle组)、脑出血+治疗组(ICH+ZLN005组)。记录各组大鼠的神经功能评分(前肢放置试验和30°角落转弯试验),7T磁共振检测脑肿胀及血肿情况,透射电子显微镜观察各组脑组织中线粒体损伤情况,Western blot检测PGC-1α以及相关炎症因子(TNF-α,IL-1β,IL-6和IL-10)的表达水平,免疫荧光检测CD16~+Iba-1~+以及CD206~+Iba-1~+细胞比例。第二部分实验1:SD成年大鼠随机分为以下7组:假手术组(sham组)、脑出血造模后3小时组(ICH 3h组)、脑出血造模后6小时组(ICH 6h组)、脑出血造模后12小时组(ICH 12组)、脑出血造模后24小时组(ICH 24组)、脑出血造模后48小时组(ICH 48组)、脑出血造模后72小时组(ICH 72组)。Western blot检测各时间点的TOM70以及MICU1水平,免疫荧光染色观察TOM70和MICU1分别与Iba-1共定位情况。实验2:SD成年大鼠随机分为以下4组:假手术组(sham组)、脑出血组(ICH组)、脑出血+溶剂组(ICH+Vehicle组)、脑出血+治疗组(ICH+ZLN005组)。透射电子显微镜观察各组脑组织中线粒体损伤情况,Western blot检测TOM70、MICU1表达水平,ATP检测试剂盒检测ATP含量水平。实验3:SD成年大鼠随机分为以下5组:脑出血+溶剂组(ICH+Vehicle组),脑出血+治疗组(ICH+ZLN005组),脑出血+治疗+空白si RNA组(ICH+ZLN005+scramble si RNA组)、脑出血+治疗+PGC-1αsi RNA组(ICH+ZLN005+PGC-1αsi RNA组)以及脑出血+治疗+TOM 70 si RNA组(ICH+ZLN005+TOM70 si RNA组)。Western blot检测PGC-1α、TOM70、MICU1以及相关炎症因子(TNF-α,IL-1β,IL-6和IL-10)的表达水平,ROS及ATP检测试剂盒分别检测ROS及ATP水平,免疫荧光检测CD16~+Iba-1~+以及CD206~+Iba-1~+细胞比例。结果第一部分ICH发生后72小时,PGC-1α表达显著升高,大鼠的各项神经功能评分显著降低,脑肿胀明显,活性氧积聚,促炎性炎症因子的表达上升,血肿周围M1型小胶质/巨噬细胞比例明显增加。每天以2.5mg/kg剂量静脉给与ZLN005后,PGC-1α表达进一步升高,大鼠神经功能评分明显改善,活性氧含量下降,脑水肿减轻,减缓颅内血肿的溶解,降低炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达,上调IL-10的表达。同时,血肿周围M2型小胶质/巨噬细胞比例升高,相应的,M1型小胶质/巨噬细胞比例降低。第二部分ICH发生后,TOM70以及MICU1表达显著下调,并在72小时达到最低。TOM70、MICU1在小胶质细胞中高表达,免疫荧光双重染色提示TOM70和MICU1均定位于胞质中。ICH 72小时后,TEM线粒体形态呈空泡化,ATP含量下降,给予ZLN005能够恢复TOM70、MICU1的表达以及线粒体定位,并使ATP含量上升,恢复线粒体形态结构。提前给予PGC-1α或TOM70特异性小分子干扰RNA,能够逆转ZLN005的保护作用,结论第一部分通过ZLN005特异性激动PGC-1α能够改善脑出血引起的脑水肿,减缓血肿溶解,促进小胶质/巨噬细胞朝M2型转化,减轻脑出血后的炎症反应,从而改善大鼠神经功能,在脑出血后起到神经保护作用。第二部分PGC-1α通过调控TOM70/MICU1线粒体通路,改善线粒体功能,从而减轻ICH后的炎症反应,促进小胶质细胞的极化。