论文部分内容阅读
非生物逆境如营养匮乏、干旱和盐分是全球范围内限制作物植株生长及产量形成的重要因素。揭示植物抗逆分子机制对于改善作物耐逆能力具有重要实践意义。本研究以实验室前期工作积累为基础，对应答低氮胁迫的小麦miRNA家族成员TaMIR444a、盐分、干旱逆境胁迫下表达基因Ta NF-YB2;3、应答低磷胁迫的RNA识别基序TaRR、蛋白激酶c受体(RACK1)基因TaRACK1和细胞分裂素响应因子基因TaARR的分子特征及其耐逆功能进行了研究。主要研究结果如下: 1、低氮胁迫下，TaMIR444a及其烟草同源基因NtMIR444a在植株根、叶中均呈上调表达特征，其靶基因应答低氮胁迫的特征与此相反。表明miR444a为单、双子叶植物中均存在的miRNA家族成员，与作用靶基因构建miRNA/靶基因模块。与野生型(wild type，WT)相比，超表达TaMIR444a的烟草株系表现出抵御低氮胁迫的能力增强，植株生长特性、生物量、氮含量、光合参数和抗氧化酶活性明显改善。基因芯片转录谱分析表明，超表达TaMIR444a株系对大量归属于不同功能类别的基因在转录后水平进行调控，包括信号感知及转导、转录调控、主要和次要代谢、植物激素响应、细胞保护及防御反应等类别。介导植株硝酸盐吸收的硝酸转运蛋白(NRT)基因NtNRT1.1-s、NtNR T1.1-t和NtNR T2.1以及调控逆境下植株体内细胞活性氧(ROS)内稳态的抗氧化酶基因NtCAT1;1、NtPOD1;3和NtPOD4在转基因株系中的表达明显上调，表明上述基因通过增强表达，改善转基因株系在低氮胁迫下的植株氮吸收能力及活性氧清除功能。研究证实，miR444a通过调控氮素吸收、活性氧内稳态和碳同化相关网络参与植株对低氮逆境胁迫的抵御。 2、在富集干旱特异表达基因的小麦根系cDNA文库中，获得了Ta NF-YB2;3的表达序列标签(EST)，进一步获得了对应上述EST的cDNA全长序列。TaNF-YB2;3的cDNA全长为780 bp，编码209个氨基酸，蛋白分子量为22.05 kD，蛋白等电点(pI)为5.85。亚细胞定位预测分析表明，TaNF-YB2;3位于胞外。系统进化分析表明，TaNF-YB2;3与大麦种属中同源基因高度同源。遗传转化TaNF-YB2;3研究及基因功能鉴定结果表明，与对照WT相比，超表达TaNF-YB2;3的转基因植株在干旱和盐分胁迫下的生长特征得到明显改善，表现为植株地上、地下部干鲜重均明显增加，叶面积显著增大。表明TaNF-YB2;3具有增强植株抵御干旱和高盐胁迫的能力。表达分析结果表明，在盐分、干旱、脱落酸(ABA)处理后，遗传转化Ta NF-YB2;3株系叶片中的特定ABA受体基因PYL/P YR、ABA信号途径关键基因SnRK和调控细胞内活性氧内稳态的抗氧化酶基因AEE呈上调表达。说明TaNF-YB2;3通过调控上述类别的特定基因参与渗透胁迫逆境下植株体内ROS内稳态和ABA信号转导通路的调节，增强转基因植株的抗逆能力。对干旱、盐分及ABA处理后转基因系气孔关闭结果显示，遗传转化Ta NF-YB2;3对气孔运动产生调节，逆境下其气孔关闭速度加快，由此增强植株在脱水逆境下的细胞和组织保水能力。暗示TaNF-YB2;3可能通过ABA依赖途径参与植株对逆境胁迫的响应。 3、在富集丰、缺磷特异表达基因的小麦根系cDNA文库中，获得了TaRRM、TaRA CK1和TaARR的表达序列标签(EST)，进一步获得了对应上述EST的cDNA全长序列。TaRRM、TaRACK1和TaARR的cDNA全长分别为881、1064和1647 bp，编码189、335和520个氨基酸，蛋白分子量分别为21.0、36.2、57.95 kD，蛋白等电点(pI)为9.47、6.32和6.34。亚细胞定位预测分析表明，TaRRM和TaARR定位于胞外，TaRACK1定位于胞质。系统进化分析表明，TaRRM与玉米、黄瓜、可可和葡萄种属中同源基因高度同源;TaRACK1与大麦和短柄草同源基因高度同源;TaARR与亚麻芥、马铃薯、番茄、芝麻、大麦和苜蓿等植物种属中同源基因高度同源。对TaRRM、TaRACK1和TaARR在低氮、低磷、盐分和干旱等逆境下的表达模式研究表明，上述基因在根中的表达受到低氮与低磷胁迫诱导，表现为表达水平随处理时间增长而逐渐增强，对盐分和干旱逆境不产生应答。在构建上述基因上、下调双元表达载体基础上，利用农杆菌介导法进行了小麦和烟草遗传转化，获得TaRA CK1和TaARR转基因烟草T2种子。为进一步阐明上述基因介导植株抵御磷、氮胁迫的能力及机制奠定了基础。 综上所述，小麦小分子RNA miR444a通过调节氮吸收、活性氧解毒作用和碳同化相关调控网络介导植株抵御低氮逆境胁迫;Ta NF-YB2;3通过调控AEE、PYLPYR、SnRK基因表达增强植株的保护酶活性、调控根系生长和ABA信号转导通路，进而增强转基因植株的抗逆能力。TaRRM在氮磷胁迫条件下呈下调表达，TaRA CK1和TaARR在氮磷胁迫下表达上调。本研究利用农杆菌介导遗传转化法建立了TaRRM、TaRA CK1和TaARR烟草及小麦转基因株系。上述基因的功能有待于进一步的研究。