论文部分内容阅读
目的为了研究治疗卵巢癌新药,以人卵巢癌SKOV3细胞为研究对象,观察不同浓度Cpd 5(2-(2-巯基乙醇)-3-甲基-1,4-萘醌)对细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用,并探讨其作用机制。方法常规培养细胞,随机分为:空白对照组、实验组和阳性对照组。经不同浓度的Cpd 5处理细胞,于不同时间,镜下观察细胞形态学变化;台盼蓝排染法、四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖抑制率;AnnexinV/PI双标记流式细胞术及荧光显微镜检测细胞凋亡诱导;TUNEL(TdT-mediated dUTP nick-end labeling)法和Hoechst-33258染色检测凋亡细胞,并计算细胞凋亡指数(apoptotic index,AI);免疫细胞化学染色SP二步法检测雌激素受体α(estrogen receptor,ER-α)、Caspase-3(Cysteine aspartic acid specific protease-3)及Cdc25A(cell division cycle)表达。结果1.光镜观察:阴性对照组中细胞形态未见明显变化;实验组:小浓度组(5、10μmol/L)细胞形态未见明显变化;30μmol/L浓度组处理细胞24小时、40、50和60μmol/L浓度组处理细胞12小时后可见细胞皱缩变圆、透光度增加、细胞膜出泡、核浓缩等形态改变,培养液中分别出现数量不等的漂浮细胞。2.MTT检测:实验组:Cpd 5处理48小时,各浓度组(5、10、20、30、40、50、60μmol/L)增殖抑制率分别为2.77%,5.19%,10.61%,41.15%,71.37%,82.90%,89.81%。用药12、24、48和72小时,细胞生长抑制率存在剂量-时间依赖关系。较大剂量(30、40、50、60μmol/L)组,各时间段细胞生长抑制率均明显高于阳性对照组(DDP)(p<0.01)。台盼蓝排染结果:Cpd 5处理组,细胞生长活力随时间和浓度递增而下降,与MTT检测结果相似,也呈时间和剂量依赖。3.流式细胞术检测:30μmol/LCpd 5处理12、24和48小时,细胞凋亡率分别为9.25%,20.07%和56.16%;50μmol/L组细胞凋亡率明显高于30μmol/L组及阳性对照组(p<0.01),且随时间增加而显著增加,亦存在剂量-时间依赖性。4.Annexin V-EGFP/ PI双染:实验组比阴性对照组凋亡细胞明显增多;Hoechst-33258染色:Cpd 5作用24、48小时,细胞凋亡形态改变明显,20μmol/L组凋亡率增加,30、40、50、60μmol/L各组凋亡率显著增加。5.TUNEL监测:阴性对照组凋亡细胞很少;Cpd 5组多数细胞皱缩、核固缩、染色质边集、凝集成块,可见散在的凋亡小体,核呈棕黄或棕黑色,随浓度增加,阳性细胞增多。6.免疫细胞化学染色:ERα定位于细胞核,阴性对照组呈强阳性表达,随药物浓度增加,各实验组细胞ERα表达逐渐减弱。Caspase-3在空白对照组细胞中低表达或不表达;实验组细胞核深染,胞质亦见染色,阳性表达随剂量增加而明显增多。Cdc25A定位于细胞核内,阳性细胞数随药物浓度增加而减少,与药物浓度呈负相关。结论:Cpd 5以剂量-时间依赖方式显著抑制人卵巢癌SKOV3细胞增殖并诱导调亡,诱导细胞凋亡的机制与调高Caspase-3和调低Cdc25A、ERα有关。