论文部分内容阅读
目的:本实验采用氧化低密度脂蛋白（Oxiidized low-density lipoprotein,ox-LDL）诱导人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelia Cells,HUVEC）,从内皮炎性损伤角度出发,观察血塞通含药血清对泛素蛋白酶体通路（Ubiquitin-proteasome pathway,UPP）/NF-κB的调控机制,进一步探讨对动脉粥样硬化的防治作用。方法:采用血清药理学方法,首先制备含药血清:28只SD大鼠喂养1周后,称重随机分为4组:空白组、辛伐他汀组、血塞通低剂量、血塞通高剂量。空白组:灌胃蒸馏水（1mg/100g/d）血塞通低剂量组:血塞通混悬液37.5mg/kg/d血塞通高剂量组:血塞通混悬液75mg/kg/d辛伐他汀组:辛伐他汀混悬液5mg/kg/d。给药一周,每天分别两次灌胃。末次给药2小时后,水合氯醛麻醉,股动脉采血,每只约10mL,静置2小时,离心,取上清,于超净台过滤到无菌无酶冻存管置于-20℃冰箱保存备用。采用细胞培养技术体外培养HUVEC细胞:取36代生长良好的HUVEC细胞,以1×105接种在培养瓶中,置于37℃,5%CO2培养箱中培养48h。待细胞生长融合成单层,弃上清,加入无血清培养基,将细胞分组:正常对照组、ox-LDL组、血塞通低剂量血清组、血塞通高剂量血清组、辛伐他汀血清对照组,正常对照组和ox-LDL组分别加入培养基及空白血清,其他组加入含药血清。除正常对照组外其余各组加入ox-LDL进行干预,同时正常对照组和ox-LDL组加入空白血清,其他组加入含药血清。MTT法分别检测24小时、48小时、72小时的光密度（Optical density,OD）值,采用免疫组化检测泛素蛋白（Ubiquitin,Ub）的表达,酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞上清中细胞间黏附因子（Intercellular adhesion factor,ICAM-1）和20S（Proteasome 20）蛋白酶体的表达,RealTime-PCR测定NF-κB、Ub、泛素活化酶（Ubiquitin activating enzyme,E1）的mRNA的表达。结果:1.MTT检测结果显示,ox-LDL诱导HUVEC抑制增殖活性最佳时间为48小时。2.倒置显微镜下观察,正常对照组细胞呈多角形,核圆,居中,细胞的边界清晰,呈铺路石状排列;ox-LDL组细胞数量减少,细胞的间隙变宽,细胞收缩,变圆,包膜皱缩,细胞的边界不清,观察有部分细胞脱落,变亮,悬浮凋亡细胞明显增多。辛伐他汀组细胞间少许细胞凋亡,细胞形态趋于正常;血塞通低剂量血清组细胞间有少许悬浮凋亡细胞,细胞形态趋于正常。血塞通高剂量血清组细胞间隙变窄,形态趋于正常。3.血塞通高、低剂量血清组NF-κBmRNA表达明显减弱,ICAM-1表达减弱。4.血塞通高、低剂量血清组Ub、E1mRNA表达含量显著减弱,20S蛋白酶体表达上调。5.血塞通高剂量血清组与血塞通低剂量血清组相比,NF-κBmRNA、E1mRNA表达含量降低,20S表达上调。结论:1.通过氧化低密度脂蛋白干预,可致人脐静脉内皮细胞（HUVEC）损伤。2.血塞通血清可下调ox-LDL损伤人脐静脉内皮细胞中NF-κB,ICAM-1炎性介质的表达。3.血塞通血清下调NF-κB及泛素活化酶（E1）mRNA表达,上调20S蛋白酶体水平,降低泛素蛋白Ub合成,从而抑制UPP/NF-κB炎症信号转导通路,减轻炎症反应,保护血管内皮细胞,可能是其防治动脉粥样硬化的作用机制之一。4.血塞通高剂量血清组较血塞通低剂量血清组的治疗效果优。