研究目的:病毒性心肌炎是指由多种病毒感染引起,以心肌细胞变性、坏死、间质炎性细胞浸润和纤维渗出为主要改变的心肌疾病。其致病病毒以柯萨奇B组病毒（CVB）最为主要,而在CVB的六个血清分型中,CVB₃具有强嗜心性,因此,当前主要针对CVB₃感染建立病毒性心肌炎模型来开展各项研究,本课题选择病毒性心肌炎作为研究对象的主要原因是,本病自身有很高的危害性,如小儿及成人的各个年龄阶段均可累及患病,急性期过后,又有演变为扩张型心肌病的可能性,同时,也可引起小范围爆发流行,而近年病毒性心肌炎的发病率更是呈现上升趋势,因此,针对CVB₃病毒性心肌炎的治疗机制研究显得迫在眉睫。本课题以新生2—3d大鼠体外心肌细胞培养建立CVB₃感染的VMC模型;通过Hoechst33258荧光检测心肌细胞凋亡;免疫组化法检测心肌细胞间缝隙连接蛋白Cx43、细胞骨架—肌动蛋白（actin）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）表达;透射电镜观察CVB₃心肌炎细胞感染模型心肌细胞功能、形态学改变;激光扫描共聚焦显微镜实时动态检测心肌细胞游离Ca²⁺变化及细胞间缝隙连接通讯功能。试图验证益气活血中药复方具有减轻CVB₃病毒性心肌炎心肌细胞免疫损伤;抑制心肌细胞凋亡发生;调节细胞内游离Ca²⁺浓度;改善细胞间缝隙连接通讯;修复心肌细胞骨架及超微结构的作用,进一步证实益气活血中药复方是治疗CVB₃病毒性心肌炎的有效方剂,益气活血法是治疗本病的有效方法。材料与方法:①益气活血中药复方细胞毒性测定:取复苏的Hela细胞,经培养瓶传代后,以每孔0.2ml接种到96孔细胞培养板中,置37℃,5%二氧化碳培养箱中培养,当Hela细胞呈单层贴壁生长时,测益气活血中药复方最大无毒剂量。用DMEM培养液将益气活血中药复方注射液从原液开始配制成11个浓度。每孔0.2ml,每个浓度设4个复孔,另设4个加正常生长液的对照孔。分别于24h、48h观察细胞生长状态,参考正常对照孔细胞形态,以不引起细胞病变的最大药物稀释浓度为最大无毒浓度（TD₀）。②CVB₃病毒毒力滴定:于96孔培养板中制备单层生长的Hela细胞,弃去培养板中的生长液,以HBSS液洗涤各培养孔2次。用含2%胎牛血清的维持液,将CVB₃病毒以10倍浓度从10^-1稀释到10^-8,每孔0.1ml,接种于96孔培养板中,每个浓度设4个复孔,另设4个正常对照孔,各加维持液0.1ml,置于37℃,5%二氧化碳培养箱中培养,分别于24h、48h观察细胞病变情况。③益气活血中药复方对CVB₃致心肌细胞死亡的抑制实验（MTT法）:取对数生长期心肌细胞,每孔加入0.2ml半数组织感染量浓度CVB₃病毒吸附心肌细胞2h。吸弃含病毒培养液,以含2%胎牛血清的维持液轻轻洗涤一遍后,加入从药物最大无毒剂量起始稀释8个浓度的含益气活血中药复方的生长液,每孔0.2ml,每个浓度设4个复孔,另设1个调零孔。于48h后,每孔加入0.18ml DMEM培养液,再加入0.02ml MTT溶液,放入培养箱继续培养4h,小心吸弃孔内培养液,每孔加入0.15ml DMSO,置振荡器上振荡8min,于酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值（OD）。④益气活血中药复方对CVB₃病毒性心肌炎心肌细胞凋亡的影响:正常分离培养乳鼠心肌细胞,接种于24孔培养板做细胞爬片,48h后取单层贴壁生长达70—80%的正常组、病毒组、中药干预组心肌细胞玻片,以PBS冲洗2次,每孔加入甲醇冰醋酸固定10min,PBS冲洗2次,每孔加入Hoechst33258染色液1ml（5μg/ml）,避光反应15min,PBS冲洗3次,每次3min,滴加0.05ml抗荧光淬灭封片剂做封片处理,于荧光显微镜下观察。⑤益气活血中药复方对CVB₃病毒性心肌炎心肌细胞cTnI、Gx43、actin表达的影响:采用SABC免疫组化法检测cTnI、Cx43、actin表达:用3%H₂O₂孵育长有细胞的玻片10min,PBS冲洗。滴加正常山羊血清封闭液,室温孵育15分钟,倾去,勿洗。滴加1:100比例稀释的一抗,37℃温育2h,PBS冲洗,滴加生物素化二抗,37℃孵育30min。PBS冲洗3次,每次5min。滴加SABC复合物,37℃湿盒孵育30min。PBS冲洗3次,每次5min,DAB显色,自来水冲洗,苏木素复染,脱水、透明处理,树脂封片,镜下观察。⑥透射电镜检测益气活血中药复方对CVB₃病毒性心肌炎心肌细胞超微结构的影响:正常培养心肌细胞72h后,用HBSS液冲洗正常组、病毒组、中药组心肌细胞,0.25%的胰酶消化3—5min,收集细胞至1.5mlEP离心管中,1500rpm离心10min,弃上清,以2.5%戊二醛固定,送电镜检查。⑦荧光漂白恢复（FRAP）检测CVB₃病毒性心肌炎心肌细胞间缝隙连接通讯功能:于单层贴壁生长达70—80%的心肌细胞中,加入以Ca²⁺、Mg²⁺PBS配成10μg/ml 6—CFDA的应用液,于37℃,5%CO₂培养箱中避光孵育30min,取出后PBS漂洗后,加入适量含Ca²⁺、Mg²⁺的PBS后,上共聚焦显微镜检测。⑧益气活血中药复方对CVB₃病毒性心肌炎心肌细胞游离钙浓度的影响:于共聚焦专用培养皿中正常培养乳鼠心肌细胞,于37℃,5%CO₂培养箱中避光负载Fluo-3 AM钙离子荧光探针30min,hanks漂洗后,上共聚焦显微镜检测。结果:①益气活血中药复方细胞毒性测定:益气活血中药复方最大无毒剂量为7.813mg/ml。②CVB₃病毒毒力滴定:CVB₃病毒50%培养细胞感染量为1×10^-4.5。③益气活血中药复方对CVB₃致心肌细胞死亡的抑制实验（MTT法）:益气活血中药复方最大无毒剂量干预CVB₃攻击后的心肌细胞时,其吸光度值亦最大,与其它稀释度组比较,差异显著,P＜0.001,证实益气活血中药复方最大无毒剂量具有明显的抑制CVB₃致心肌细胞死亡作用。④益气活血中药复方对CVB₃病毒性心肌炎心肌细胞凋亡的影响:正常组心肌细胞核呈圆形、卵圆形,未见凋亡细胞核,而100×镜下观察病毒组心肌细胞核,呈现出成片的亮蓝色,400×镜下观察可见细胞核形态不完整,呈碎片状分布,也可见分叶状细胞核。中药组心肌细胞核多呈圆形,未见明显的凋亡细胞核形态,提示益气活血中药复方可抑制CVB₃感染后细胞凋亡发生,具有保护心肌作用。⑤益气活血中药复方对CVB₃病毒性心肌炎心肌细胞cTnI表达的影响:免疫组化检测心肌肌钙工（cTnI）表达结果显示,正常组cTnI未见有明显阳性棕褐染色。病毒感染组cTnI呈强阳性（+++）表达,棕褐色阳性信号多且色深,与正常组阳性目标平均光密度比较,差异显著,P＜0.05。中药干预组cTnI呈弱阳性（+）表达,水平明显下降,与病毒组比较,差异显著,P＜0.01。⑥益气活血中药复方对CVB₃病毒性心肌炎心肌细胞Cx43表达的影响:免疫组化检测Connexin 43蛋白发现,正常组心肌细胞呈强阳性（+++）表达,而病毒组Cx43呈极弱阳性（±）表达,与正常组阳性目标平均光密度比较,差异极其显著,P＜0.001。中药治疗组Cx43呈阳性（++）表达,与病毒组比较,差异显著,P＜0.05。⑦益气活血中药复方对CVB₃病毒性心肌炎心肌细胞actin表达的影响:免疫组化检测肌动蛋白（actin）结果显示,正常组心肌细胞actin呈强阳性（+++）表达。病毒组actin呈弱阳性（+）表达,与正常组比较,差异显著,P＜0.05。中药治疗组actin呈阳性（++）表达,与病毒组比较,P＜0.01。⑧透射电镜检测益气活血中药复方对CVB₃病毒性心肌炎心肌细胞超微结构的影响:CVB₃感染组与正常组心肌细胞相比,细胞器损伤严重,表明CVB₃病毒性心肌炎模型建立成功,而中药干预组心肌细胞形态及细胞器结构接近正常组,与模型组比较差异明显,表明益气活血中药复方能防御并减轻CVB₃造成的心肌损伤,具有修复损伤心肌细胞超微结构的作用。⑨荧光漂白恢复（FRAP）检测CVB₃病毒性心肌炎心肌细胞间缝隙连接通讯功能:正常心肌细胞间缝隙连接通讯功能良好,病毒组心肌细胞漂白后荧光恢复率显著低于正常组心肌细胞,差异明显,P＜0.05,中药组漂白后荧光恢复率明显升高,与病毒组比较差异显著,P＜0.01。⑩益气活血中药复方对CVB₃病毒性心肌炎心肌细胞游离钙浓度的影响:益气活血中药复方对正常心肌细胞静息状态内钙无明显影响,P＞0.05,而能提高CVB₃攻击的心肌细胞内钙离子浓度,差异明显,P＜0.05。结论:1.以新生大鼠原代心肌细胞体外培养方法,成功建立了CVB₃攻击的心肌细胞感染模型。2.本实验从免疫、分子、蛋白及细胞超微结构等层次水平上,揭示益气活血中药复方防治病毒性心肌炎心肌损伤机制,体现了中医药学着眼于“整体”的辨治理念。3.通过对细胞凋亡、细胞内游离Ca²⁺、细胞间缝隙连接通讯、Cx43、actin、cTnI及心肌细胞超微结构等进行功能学检测和形态学观察,证实了以益气活血药为主组成的中药复方,具有多作用、多层次、多靶点效应。4.本实验进一步证实了益气活血法是治疗VMC的有效法则,而益气活血中药复方是治疗VMC的有效方剂,提示本方在VMC的治疗中具有广阔的应用前景。