脓毒症(sepsis)具有高患病率、高病死率、高治疗费用的特点,受到了基础医学与临床的高度关注,已成为当前生命科学领域的研究热点。流行病学分析显示,25-30%脓毒症是由于革兰阴性(G-)菌感染所引起。内毒素作为G-菌细胞壁结构成分之一,化学本质为脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)。进入血液循环的LPS与LPS结合蛋白(LPS binding protein, LBP)结合形成复合体,被转运至单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞以及血管内皮细胞膜表面的CD14 (cluster of differentiation 14)。CD14分子由于缺乏胞浆区,无法将LPS信号转导入胞内,因此LPS信号需要借助膜上的Toll样受体4(toll like receptor 4, TLR4)才能下传。TLR4在辅助受体MD-2的辅助下,通过酪氨酸蛋白激酶激活胞内髓样分化蛋白88(myeloid differentiation protein 88, MyD88),随后激活MyD88依赖的核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号转导通路,最后激活核转录因子激活蛋白-1 (activator protein-1,AP-1)和NF-κB等。AP-1和NF-κB由胞质转移到胞核,启动靶基因的转录和表达,诱导多种细胞因子如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)、干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)、白介素-1β(interleukin, IL-1β)、IL-6和IL-8等的释放。随后活化炎症级联反应的二级水平和激活获得性免疫系统,即刺激单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、血管内皮细胞等释放更多的细胞因子和炎症因子,引起全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、脓毒症(sepsis)、严重脓毒症(severe sepsis)、脓毒性休克(septic shock)和难治性脓毒症(refractory septic shock)。肝脏是脓毒症状态下容易受损的器官之一。与正常状态肝脏细胞相比较,脓毒症状态下,肝脏Kupffer细胞和血管内皮细胞的结构与功能发生改变,细胞膜表面分子表达增加或活性部位暴露。这些差异分子与脓毒症的发生发展密切相关,有可能作为脓毒症诊断和治疗的靶点。筛选与这些细胞膜表面差异分子特异性结合的短肽,对于寻找炎症因子拮抗剂、绘制内毒素休克肝脏细胞特异性结合肽图谱、研究LPS介导的炎症信号转导机制、探索内毒素休克的治疗策略都具有重要意义。1985年,Smith发明了噬菌体展示技术(phage display)。他将EcoRⅠ核酸内切酶编码基因插入噬菌体衣壳蛋白pⅢ编码基因中,使噬菌体表达EcoRⅠ核酸内切酶与噬菌体衣壳蛋白pⅢ的融合蛋白,该融合蛋白可以被EcoRⅠ核酸内切酶特异性抗体有效地识别,说明噬菌体表达的外源蛋白与衣壳蛋白的融合蛋白能够保持外源蛋白的天然构象与活性。噬菌体肽库构建的基本原理是将外源蛋白编码基因插入噬菌体衣壳蛋白编码基因中,使外源蛋白与噬菌体衣壳蛋白融合表达。噬菌体肽库的筛选基于蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)的原理。蛋白质之间的相互作用取决于蛋白质的三维空间结构,而蛋白模体(motif)是影响蛋白质相互作用的关键结构。大量的生物学实验表明,由数个氨基酸构成的蛋白模体,可以小到只有三个氨基酸残基构成,但仍可模拟蛋白质的某些关键结构特征。因此,含关键性氨基酸残基的噬菌体短肽,可以模拟蛋白质-蛋白质相互作用位点。1996年,Pasqualini和Ruoslahti首次使用体内噬菌体展示技术(in vivo phagedisplay)筛选得到正常小鼠脑和肾的特异性结合肽。随后,他们将该技术应用于肿瘤靶向性治疗方面的研究,结果表明体内噬菌体展示技术筛选得到的短肽具有重要的生物学作用。同时,他们的研究也证明小鼠各脏器和组织的血管内皮细胞表面分子存在异质性,由此,他们提出了血管蛋白质组学的概念。体内噬菌体展示技术包括吸附,洗脱和扩增3个过程,经过3-5轮的筛选可以得到特定器官或组织的特异性结合肽库,由于具有简便、高效、快速等优点,该技术已经广泛应用于肿瘤、慢性炎症和血管相关性疾病中的研究中,并且已经取得令人瞩目的研究成果。鉴于内毒素休克小鼠肝脏细胞在脓毒症发生发展中处于关键性地位,以及体内噬菌体展示技术筛选特异性结合肽的高效性,本室前期研究采用了体内噬菌体展示技术,筛选了内毒素休克小鼠肝脏细胞特异性结合肽库,并应用生物信息学分析了肽库,初步绘制了内毒素休克肝脏细胞特异性结合图谱。本研究在前期研究基础上,从内毒素休克小鼠肝脏细胞特异性结合肽库中,选取丰度最高的短肽LTTWAPA进行生物信息学分析、靶向性验证及其作用蛋白的寻找与鉴定。LTTWAPA生物信息学分析目的是预测LTTWAPA可能模拟的与内毒素休克发病相关的跨膜蛋白和分泌蛋白。分析的基本过程：首先,运用美国国立生物技术信息中心(center for biotechnology information, NCBI)在线BLAST寻找与LTTWAPA氨基酸序列相似性最高的100个蛋白质,然后,运用丹麦大学生物序列分析中心开发的信号肽预测软件SignalP及其剪切位点预测软件TMHMM,分别预测分泌蛋白和跨膜蛋白,最后,结合瑞士生物信息研究所蛋白质分析专家系统(expert protein analysis system, EXPASY)、NCBI以及相关文献对这些分泌蛋白和跨膜蛋白进行综合分析,确定其中与内毒素休克发病相关的蛋白。靶向性验证的目的是验证LTTWAPA特异性结合于内毒素休克小鼠的肝脏,验证的方法包括噬菌体回输计数和竞争性抑制实验。寻找和鉴定LTTWAPA作用蛋白的目的是确定LTTWAPA在内毒素休克小鼠肝脏的作用蛋白。基本过程是运用pull down技术捕获LTTWAPA作用蛋白,SDS-PAGE和2D-DIGE分离后进行质谱鉴定。通过研究我们得出以下结论：第一、LTTWAPA可能模拟的分泌蛋白是杀菌通透性增加蛋白(bactericidal permeability-increasing protein, BPI)、纤维连接蛋白(fibronectin, FN)、补体C5(complement C5, C5)、粒细胞集落刺激因子受体(granulocyte colony-stimulating factor receptor, G-CSF-R),跨膜蛋白是spinster同源蛋白1 (protein spinster homolog 1, Spnsl),它们都与内毒素休克发病密切相关；第二、LTTWAPA特异性结合于内毒素休克小鼠肝脏；第三、迁移抑制因子相关蛋白14(Migration inhibitory factor-related protein 14, Mrp14)可能是LTTWAPA的相互作用蛋白之一。LTTWAPA作用蛋白Mrp14的鉴定,可能对于内毒素休克诊断和治疗具有重要意义。