研究背景:据世界卫生组织及国际糖尿病联盟报道,2011年全球糖尿病的患者人数达到了一亿人。预计到2030年,全球的糖尿病患者和糖尿病前期人群将达到5亿人。糖尿病已成为威胁人类健康的重要疾病。心血管并发症是糖尿病致死致残的主要原因。糖尿病心肌病是特指发生于糖尿病患者的,以左室肥大和左室功能障碍为主要特征的,不依赖于冠心病和动脉粥样硬化等血管病变而发生的心衰综合征。探寻糖尿病心肌病的发病机制,寻找其潜在的治疗靶点,是当前亟待解决的的一个重要问题。线粒体作为心肌细胞内部的能量工厂,广泛参与着细胞内部诸如ATP合成以及氧化应激等多种生理过程,对心肌细胞的生存和心脏功能的正常维持具有重要意义。线粒体在发挥其生理作用的过程中,通过不断的融合分裂调整其自身形态以适应不同的细胞状态,线粒体不断融合分裂的过程称为线粒体动力学(Mitochondrial dynamics)。一般认为:适度的线粒体分裂可通过自噬清除受损的线粒体,维持线粒体群体的健康,但过度分裂的线粒体将对细胞的状态产生不利影响,线粒体过度分裂将导致线粒体膜电位下降,ATP产生减少,线粒体来源的氧化应激增加。新近的临床研究发现,糖尿病患者心肌组织存在明显的线粒体过度分裂现象,提示线粒体分裂可能参与了糖尿病心肌病的发生发展。本研究拟通过在体以及离体实验探讨线粒体动力学在糖尿病心肌病中的作用及其机制。研究目的:1.探究线粒体动力学障碍是否参与了糖尿病心肌病的发生发展过程2.阐明线粒体动力学障碍在糖尿病心肌病发生发展过程中的作用及机制3.探索调节糖尿病心肌线粒体动力学变化的上游分子调节机制研究方法:第一部分:糖尿病心肌病发生发展过程中线粒体形态及相关蛋白的变化8周龄2型糖尿病模型小鼠db/db小鼠以及其对照小鼠db/+,普通饲料喂养,监测小鼠的血糖、血脂、进食量以及体重变化;超声心动图监测小鼠心功能随周龄变化;透射电镜观察心肌线粒体形态变化;Western Blotting检测融合相关蛋白(Mfn1,Mfn2,Opa1)和分裂相关蛋白(Drp1,Fis1)的表达。第二部分:心肌特异性过表达Mfn2抑制糖尿病心肌病的发生发展构建Mfn2过表达腺病毒,在12周龄时向对照小鼠(db/+)和模型小鼠(db/db)心肌点注射对照腺病毒(Ad-EV)和Mfn2过表达腺病毒(Ad-Mfn2),在心肌点注射1周和4周后分别用Western Blotting和免疫组化方法对腺病毒的转染效率进行检测;点注射4周后超声心动图监测小鼠心脏功能变化,透射电镜观察心肌线粒体形态变化;HE染色观察心脏大体形态变化;Masson染色观察心肌纤维化程度;WGA染色观察小鼠心肌肥厚相关指标;TUNEL染色检测心肌细胞凋亡;观察心肌氧化应激相关指标。第三部分:离体原代心肌细胞进一步验证Mfn2在糖尿病心肌病中的作用分离大鼠原代心肌细胞,高糖高脂(25 mM葡萄糖+500μM棕榈酸钠)培养,腺病毒转染分别过表达和敲低Mfn2,Mito-Tracker Red染色观察原代心肌细胞线粒体形态学变化,JC-1染色检测线粒体膜电位变化,Western Blotting检测线粒体细胞色素C释放;流式细胞仪检测心肌细胞凋亡变化;cellular ROS染色和Mito-SOX染色分别检测细胞整体和线粒体ROS含量;Seahorse检测线粒体功能相关指标。第四部分:探索糖尿病心肌Mfn2上游调节机制应用公共数据库分析与Mfn2表达相关性最强的转录因子,并用Western Blotting检测该分子在糖尿病db/db鼠中的表达变化趋势,与Mfn2表达趋势做对比。在原代心肌细胞中应用该分子过表达腺病毒过表达该分子,观察该分子对Mfn2表达和线粒体动力学的影响。进一步应用染色质免疫共沉淀和双荧光素酶报告基因实验进一步找出该分子在Mfn2启动子区域的可能结合位点。研究结果:1.与对照db/+小鼠相比,2型糖尿病db/db鼠的体重显著增加,血糖水平和血脂均显著高于对照小鼠。从12周龄起,db/db小鼠左心室射血分数和左心室短轴缩短率明显下降,在16周龄时,db/db鼠的心功能进一步降低。这些数据表明,2型糖尿病db/db鼠从12周龄开始出现糖尿病心肌病的表现。2.伴随着心功能的降低,从12周龄起,糖尿病小鼠心肌组织线粒体呈现明显过度分裂现象,表现在与同年龄对照db/+小鼠相比,12周龄db/db小鼠心肌组织中单个线粒体面积更小,单位面积内线粒体数量更多。Western Blotting结果显示,融合相关蛋白Mfn1、Opa1和分裂相关蛋白Drp1、Fis1的表达在糖尿病心肌与对照心肌无明显差异,只有融合相关蛋白Mfn2在糖尿病心肌明显降低,且在16周龄的糖尿病小鼠心肌组织中降低更明显。3.在对糖尿病模型鼠心肌点注射Mfn2过表达腺病毒4周后,Western Blotting检测和免疫组化染色提示:相对于空载病毒(Ad-EV)注射组,Mfn2过表达腺病毒注射组糖尿病小鼠心肌组织Mfn2表达量出现明显增高。电镜结果显示,伴随着Mfn2表达量的升高,心肌线粒体的过度分裂现象得到了显著的抑制。超声心动图结果显示,上调心肌Mfn2有效改善糖尿病小鼠心脏功能,抑制心肌肥厚和心肌纤维化,减少细胞凋亡和氧化应激。4.细胞实验结果显示,相比于正常培养原代心肌细胞,高糖高脂培养心肌细胞出现了明显的线粒体过度分裂现象,Mfn2表达量也出现了明显的下调。Mfn2过表达显著抑制了高糖高脂所引起的线粒体过度分裂,恢复线粒体膜电位,抑制线粒体细胞色素c的释放,减少细胞凋亡;而在正常培养心肌细胞中敲低Mfn2可直接诱导线粒体分裂异常增加,引起线粒体膜电位降低,促进线粒体细胞色素c的释放,诱发细胞凋亡。5.Cellular ROS染色和线粒体mito-ROS染色结果显示:Mfn2过表达显著抑制高糖高脂所致的氧化应激,而正常心肌细胞敲低Mfn2可引起氧化应激的增强增高。Seahorse细胞能量代谢检测仪结果显示,高糖高脂培养心肌细胞线粒体氧化呼吸功能明显受损,过表达Mfn2可改善线粒体功能。在正常心肌细胞敲低Mfn2可直接导致线粒体功能受损。6.公共数据库数据分析显示PPARα与Mfn2表现出强相关性,提示PPARα很有可能是调节Mfn2表达的转录因子。原代心肌细胞过表达PPARα显著增强了Mfn2表达并抑制了高糖高脂所致线粒体过度分裂。染色质免疫共沉淀实验结果表明,PPARα可结合至Mfn2启动子区域。双荧光素酶报告基因实验进一步证实PPARα可以直接结合至Mfn2启动子区域“GACTGGGGACGGGGTAA”序列促进Mfn2转录。研究结论1.2型糖尿病心肌发生发展过程中线粒体分裂异常增加,融合相关蛋白Mfn2表达下调。2.上调Mfn2可抑制糖尿病心肌线粒体分裂,抑制线粒体凋亡途径,减轻氧化应激,改善线粒体氧化呼吸功能,抑制糖尿病心肌病的发生发展。3.糖尿病心肌PPARα表达量下降是Mfn2表达量下调主要原因,PPARα可以直接结合至Mfn2启动子区域“GACTGGGGACGGGGTAA‖促进Mfn2转录。