目的:本实验通过观察1，25-二羟维生素D3对树突状细胞（dendritic cells，DCs）的表型、功能以及对其TLR4、TLR7表达的影响，探讨TLR4、TLR7在1，25-二羟维生素D3诱导耐受性DCs中可能的作用。为以后研究三者在自身免疫性疾病中的关系奠定基础，同时也为治疗及预防自身免疫性疾病提供新的思路。方法:采用C57BL/6小鼠为供体，雌雄不拘，无菌取小鼠胫骨和股骨骨髓，用红细胞裂解液溶去红细胞后PBS洗2次，利用含rmGM-CSF （20ng/mL）, rmIL-4（10ng/mL）的RPMI1640培养基调整细胞浓度至1×10⁶/mL，置于6孔板中。分别根据加和不加10^-8mol/L1,25-（OH）₂D₃，将细胞分成加药组(10^-8mol/L1,25-（OH）₂D₃)和对照组（等体积RPMI1640），相同的温度、湿度及CO2浓度下培养。24h后轻轻吸弃上清液，去除悬浮细胞，及时补充含细胞因子浓度相同的完全培养基。分别于第3、5d换液，并于第5d加入1μg/ml的LPS刺激DCs成熟，继续培养48h,第7天收集细胞用于后续实验。1.采用倒置显微镜观察每日观察DCs形态的变化。2.使用流式细胞仪检测两组DCs表型变化：分别收集两组细胞，加入FITC-CD80,PE-cy5-CD86,PE-MHCⅡ单克隆抗体进行荧光标记，流式细胞仪进行表型分析。3.混合淋巴细胞反应：分别收集两组DC，作为刺激细胞。取正常C57BL/6小鼠脾脏，尼龙毛吸附法制备纯化T细胞，作为反应细胞。刺激细胞与反应细胞按1:10、1:50和1:100混合培养，采用CCK-8比色法检测1,25-（OH）₂D₃组及对照组DC对T淋巴细胞增殖的影响。4.利用RT-PCR半定量方法测定1,25-（OH）₂D₃组及对照组中DCs的TLR4、TLR7mRNA相对表达量。结果:1.显微镜下小鼠骨髓来源的细胞，在rmGM-CSF和rmIL-4作用1d后，多数细胞仍呈圆形贴壁生长，部分区域出现较少不规则形状的细胞。作用2-3d后，细胞明显增大，单个散在的细胞逐渐集聚成簇状细胞集落。5d以后，细胞集落增大，集落的周围有许多毛刺状突起，可见少量具有突起的悬浮细胞。加入LPS继续培养48h后，细胞集落较前减少，悬浮细胞明显增多，光镜下可见细胞形态不规则，表面有大量树枝状、伪足状、长短不一的突起，呈现典型的DCs形态2.流式细胞术（FCM）结果表明1,25-二羟维生素D3处理后，DCs表达CD86和MHC II的荧光强度均较对照组明显降低，差异有统计学意义（p<0.05）3.细胞生长抑制试验显示在相同浓度的情况下，1,25-（OH）₂D₃组中的DC较对照组可显著地抑制T淋巴细胞的增殖。4.半定量RT-PCR发现，1,25-（OH）₂D₃组中DCs其TLR7/β-actin的比值较对照组有显著降低（p<0.05），而TLR4差异不明显（p>0.05）。结论：（1）1,25-（OH）₂D₃可以抑制LPS刺激DCs成熟，诱导耐受性DCs；（2）1,25-（OH）₂D₃诱导的DCs低表达CD86、MHCⅡ，并且对T细胞的刺激能力也较成熟DCs弱；（3）1,25-（OH）₂D₃可能通过下调TLR7的表达，从而下调DC表面共刺激分子，降低其功能，抑制DCs成熟。故TLRs在诱导DCs的成熟及耐受性过程中起着重要作用。