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百花花楸(Sorbus pohuashanensis)属蔷薇科花楸属落叶小乔木,是一种潜力巨大的可药用树种.本研究从百花花楸成熟果实中制备了两类活性成分,分别是β-谷甾醇(Sit)和总三萜(Trds),并对Sit进行了结构修饰.进而,对Sit及其衍生物、Trds进行了质量评价和药理活性研究.其主要研究内容及结果如下:
1.Sit及其衍生物的制备首先,以百花花楸成熟干燥的果实为实验材料,75%乙醇超声提取,减压浓缩至小体积,进行干燥处理.之后加入20%KOH进行加热回流,乙醚萃取,浓缩得到浅黄色膏状物,加入95%乙醇进行加热溶解.之后4℃静置,析出的白色晶体即为Sit,并用HPLC法测定了其含量.然后,采用本实验室已报道的实验方法,对Sit进行衍生化处理,共制备得到了8种Sit衍生物,并分别对其溶解度进行测定,研究发现:对Sit进行活泼位点上的结构修饰可以大幅度提高其脂溶性.
2.Trds的制备以百花花楸成熟干燥的果实为实验材料,乙酸乙酯对其进行加热回流提取,得到浅黄色粉末(三氯醋酸反应、氯仿—浓硫酸反应、冰醋酸—乙酞氯反应均为阳性)判断为三萜粗品,得率为8.2%.得到足量的三萜粗品(≥50g)后,对其进行富集并检测,利用香草醛—冰乙酸、高氯酸法显色,紫外分光光度法测定Trds中总三萜含量为64.6%;HPLC法进行Trds成分测定,发现其主要成分是熊果酸和齐墩果酸,总含量达到56.7%.
3.Sit及其衍生物抗LPS/D-GalN诱导的爆发性肝损伤研究方法:首先建立LPS/D-GalN诱导的小鼠爆发性肝损伤模型,通过生存实验进行Sit及其衍生物抗肝损伤活性筛选,之后进行2-萘甲酸-β谷甾醇酯(Sit-N)抗肝损伤实验设计(实验分为4组,给药7天).7天后处死小鼠,检测肝脏生化指标,观察肝脏病理变化,通过WesternBlot和RT-PCR研究其潜在的作用机制.结果:H&E染色发现Sit-N有效地抑制了肝脏损伤,减少了炎症表达和组织坏死.同时,Sit-N预处理还降低了血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)等炎症因子水平;显著提高了肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和过氧化氢酶(CAT)等活性,阻止了丙二醛(MDA)的生成.WesternBlot以及RT-PCR分析结果发现:LPS/GalN诱导的Toll样受体4(TLR4)和核因子κB(NF-κB)的过分表达被Sit-N所抑制;而且,Sit-N的预处理还促进了核呼吸因子2(Nrf2)和血红素氧合酶-1(HO-1)的表达.结论:Sit-N通过TLR4和Nrf2途径对LPS/GalN所诱导的爆发性肝损伤起到抑制作用.
4.Sit及其衍生物抗抑郁活性研究方法:我们通过悬尾试验(TST)和强迫游泳试验(FST)对Sit及其衍生物进行抗抑郁活性筛选,确定了水杨酸-β-谷甾醇酯(Sit-S)显著的抗抑郁样活性;随后,设计实验,确定Sit-S抗抑郁的有效剂量和次有效剂量;最后,通过ELISA法探究了其潜在的作用机制.结果:实验发现Sit-S给药组在TST中具有最少的不动时间,证明Sit-S抗抑郁样活性最强,并且,有效剂量为4mg/kg,次有效剂量为1mg/kg.随后的联合给药研究发现Sit-S(1mg/kg)与氟西汀、瑞波西汀共同给药均表现出了对抗抑郁的协同效应.通过TST试验中,不同中枢神经系统对Sit-S抗抑郁作用的影响,发现阿戈美拉汀(40mg/kg,5-羟色胺(5-HT)受体拮抗剂,5-HT2C受体拮抗剂)、氟哌啶醇(0.2mg/kg,非选择性D2受体拮抗剂)、荷包牡丹碱(4mg/kg,抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)拮抗剂)有效地阻断了Sit-S(4mg/kg)在TST中的抗抑郁作用.结论:Sit-S(4 mg/kg)对小鼠表现出的抗抑郁作用是由5-HT、多巴胺(DA)和GABAergic系统共同介导.
5.Trds抗对乙酰氨基酚(APAP)诱导的肝损伤研究.方法:首先使用APAP建立药物性小鼠肝损伤模型,在正式试验之前,设计预实验,通过检测Trds对小鼠生存率的影响来评估其安全性.在随后的试验中,主要通过测定肝脏的生化指标,肝脏病理学变化,氧化和炎症水平来评估Trds对肝损伤的有效性.最后,通过WesternBlot和RT-PCR检测研究其潜在的作用机制.结果:小鼠的生存试验证明了Trds的安全性,而且Trds不会影响正常小鼠的生化水平.实验发现单独APAP处理组小鼠表现出严重的肝损伤,但是经过Trds处理后,血清中AST(谷草转氨酶)和ALT(谷丙转氨酶)含量明显减少;肝脏组织H&E染色结果证明Trds显著地抑制了肝脏组织坏死,出血和炎性细胞浸润.Trds还大幅度提高了抗氧化酶(SOD,GSH和CAT)的活性,抑制了MDA的表达;另外,Trds降低了肝脏组织中TNF-α,IL-1β和IL-6水平,说明Trds可以减轻由APAP导致的氧化和炎症损伤.Western-blot和RT-PCR分析显示:Trds预处理有效阻止了肝脏中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶-2(COX-2)的过量表达,也抑制了丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族信号,如p38,c-jun氨基末端激酶(JNK)和细胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化表达.结论:Trds可以抗小鼠药物性肝损伤,这种肝脏保护作用与其抗氧化和抗炎症的性质有关.
1.Sit及其衍生物的制备首先,以百花花楸成熟干燥的果实为实验材料,75%乙醇超声提取,减压浓缩至小体积,进行干燥处理.之后加入20%KOH进行加热回流,乙醚萃取,浓缩得到浅黄色膏状物,加入95%乙醇进行加热溶解.之后4℃静置,析出的白色晶体即为Sit,并用HPLC法测定了其含量.然后,采用本实验室已报道的实验方法,对Sit进行衍生化处理,共制备得到了8种Sit衍生物,并分别对其溶解度进行测定,研究发现:对Sit进行活泼位点上的结构修饰可以大幅度提高其脂溶性.
2.Trds的制备以百花花楸成熟干燥的果实为实验材料,乙酸乙酯对其进行加热回流提取,得到浅黄色粉末(三氯醋酸反应、氯仿—浓硫酸反应、冰醋酸—乙酞氯反应均为阳性)判断为三萜粗品,得率为8.2%.得到足量的三萜粗品(≥50g)后,对其进行富集并检测,利用香草醛—冰乙酸、高氯酸法显色,紫外分光光度法测定Trds中总三萜含量为64.6%;HPLC法进行Trds成分测定,发现其主要成分是熊果酸和齐墩果酸,总含量达到56.7%.
3.Sit及其衍生物抗LPS/D-GalN诱导的爆发性肝损伤研究方法:首先建立LPS/D-GalN诱导的小鼠爆发性肝损伤模型,通过生存实验进行Sit及其衍生物抗肝损伤活性筛选,之后进行2-萘甲酸-β谷甾醇酯(Sit-N)抗肝损伤实验设计(实验分为4组,给药7天).7天后处死小鼠,检测肝脏生化指标,观察肝脏病理变化,通过WesternBlot和RT-PCR研究其潜在的作用机制.结果:H&E染色发现Sit-N有效地抑制了肝脏损伤,减少了炎症表达和组织坏死.同时,Sit-N预处理还降低了血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)等炎症因子水平;显著提高了肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和过氧化氢酶(CAT)等活性,阻止了丙二醛(MDA)的生成.WesternBlot以及RT-PCR分析结果发现:LPS/GalN诱导的Toll样受体4(TLR4)和核因子κB(NF-κB)的过分表达被Sit-N所抑制;而且,Sit-N的预处理还促进了核呼吸因子2(Nrf2)和血红素氧合酶-1(HO-1)的表达.结论:Sit-N通过TLR4和Nrf2途径对LPS/GalN所诱导的爆发性肝损伤起到抑制作用.
4.Sit及其衍生物抗抑郁活性研究方法:我们通过悬尾试验(TST)和强迫游泳试验(FST)对Sit及其衍生物进行抗抑郁活性筛选,确定了水杨酸-β-谷甾醇酯(Sit-S)显著的抗抑郁样活性;随后,设计实验,确定Sit-S抗抑郁的有效剂量和次有效剂量;最后,通过ELISA法探究了其潜在的作用机制.结果:实验发现Sit-S给药组在TST中具有最少的不动时间,证明Sit-S抗抑郁样活性最强,并且,有效剂量为4mg/kg,次有效剂量为1mg/kg.随后的联合给药研究发现Sit-S(1mg/kg)与氟西汀、瑞波西汀共同给药均表现出了对抗抑郁的协同效应.通过TST试验中,不同中枢神经系统对Sit-S抗抑郁作用的影响,发现阿戈美拉汀(40mg/kg,5-羟色胺(5-HT)受体拮抗剂,5-HT2C受体拮抗剂)、氟哌啶醇(0.2mg/kg,非选择性D2受体拮抗剂)、荷包牡丹碱(4mg/kg,抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)拮抗剂)有效地阻断了Sit-S(4mg/kg)在TST中的抗抑郁作用.结论:Sit-S(4 mg/kg)对小鼠表现出的抗抑郁作用是由5-HT、多巴胺(DA)和GABAergic系统共同介导.
5.Trds抗对乙酰氨基酚(APAP)诱导的肝损伤研究.方法:首先使用APAP建立药物性小鼠肝损伤模型,在正式试验之前,设计预实验,通过检测Trds对小鼠生存率的影响来评估其安全性.在随后的试验中,主要通过测定肝脏的生化指标,肝脏病理学变化,氧化和炎症水平来评估Trds对肝损伤的有效性.最后,通过WesternBlot和RT-PCR检测研究其潜在的作用机制.结果:小鼠的生存试验证明了Trds的安全性,而且Trds不会影响正常小鼠的生化水平.实验发现单独APAP处理组小鼠表现出严重的肝损伤,但是经过Trds处理后,血清中AST(谷草转氨酶)和ALT(谷丙转氨酶)含量明显减少;肝脏组织H&E染色结果证明Trds显著地抑制了肝脏组织坏死,出血和炎性细胞浸润.Trds还大幅度提高了抗氧化酶(SOD,GSH和CAT)的活性,抑制了MDA的表达;另外,Trds降低了肝脏组织中TNF-α,IL-1β和IL-6水平,说明Trds可以减轻由APAP导致的氧化和炎症损伤.Western-blot和RT-PCR分析显示:Trds预处理有效阻止了肝脏中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶-2(COX-2)的过量表达,也抑制了丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族信号,如p38,c-jun氨基末端激酶(JNK)和细胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化表达.结论:Trds可以抗小鼠药物性肝损伤,这种肝脏保护作用与其抗氧化和抗炎症的性质有关.