人类免疫缺陷病毒-1型(Human Immunodeficiency Virus-1, HIV-1)发现至今已有三十多年,人们对其发病机理和免疫学特征也有了一定的认识,但制约HIV-1疫苗研发的主要科学和技术障碍仍未能跨越,有效阻止机体感染的疫苗尚未研发成功。HIV-1具有极高的遗传多样性,并且进化出了许多机制来逃避机体免疫系统的攻击。诱导持久的细胞免疫反应和广谱中和抗体是HIV-1疫苗发展的两个重要目标。细胞免疫反应的强度和持久性受外来免疫原和体内免疫调节因子的影响。细胞因子Interleukin-21 (IL-21)作为一种重要的免疫调节因子,其受体广泛表达于各种免疫细胞表面,在调节免疫反应时具有多重效应性,因而,近年来IL-21被当作调节疫苗免疫的佐剂广泛应用于疫苗的免疫策略中来提高机体免疫应答反应。现今,部分HIV-1疫苗可以诱导出毒株特异性的中和抗体,但很难诱导出广谱中和抗体,诱导的细胞免疫反应也多不持久,这是阻碍HIV-1疫苗研究的技术瓶颈。在HIV-1自然感染者中,少部分(10%～25%)感染者中存在广谱中和血清反应,机体能够在和病毒的长期斗争中产生广谱中和抗体。从这些感染者中寻找广谱中和抗体,并深入研究其产生发展和成熟的过程,是一项重要的保护性体液免疫机制研究,其结果将有助于设计能诱导广谱中和抗体的新型疫苗,同时也为治疗提供了备选的免疫制剂。本论文研究针对以上HIV-1疫苗研究的两个重要领域,展开两个方面的研究。一、细胞因子佐剂IL-21调节HIV-1疫苗诱导细胞免疫反应的研究本研究系统评价了HIV-1 DNA疫苗初免-rTV/蛋白疫苗加强免疫策略在小鼠中诱导的免疫应答反应,发现该免疫策略能够诱导出广泛持久的HIV-1特异性抗体反应(IgG、IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)、特异性细胞因子的分泌(IFN-γ、IL-2和TNF-α)和多功能性T细胞。然后以此为基础,以细胞因子IL-21为佐剂与疫苗共免疫小鼠,观察IL-21对疫苗诱导免疫反应的调节效应,结果发现IL-21能够提高Thl型免疫反应、显著增强CD4+T细胞和CD4+ TEM细胞分泌特异性IFN-γ和]TNF-α的能力,显著提高多功能性CD4+T细胞和CD4+ TEM细胞的比例、显著提高NK细胞的比例。二、HIV-1单克隆广谱中和抗体的筛选及其进化成熟机制研究本部分研究以本实验室发现的中国可产生广谱中和抗体的H1V-1感染者为切入点,分离出了多个中和宽度有限的HIV-1中和抗体,并对其中一个感染者2005年至2009年血液样本进行深入研究,系统分析了广谱中和抗体的发生发展和成熟的过程。通过与TSRI (The Scripps Research Institute)科学家合作单细胞分选分离得到了产生抗HIV-1膜蛋白抗体的B细胞。采用单克隆抗体扩增和表达技术获得了单克隆抗体DRVIA7;特异性表位分析确定该抗体靶向CD4结合位点(CD4bs);经Global和DRVI两个中和测定盘(Global Panel, DRVI Panel)标定,发现其具有抗HIV-1中和活性,但其中和宽度有限(33%,36%)。基因分析发现其重链来源于IgHV1-02*02家系、体细胞突变率为19%,轻链来源于IgKV1-05*03、体细胞突变率为17%,可能为一种类VRC01中和抗体。合作单位TSRI科学家对该单克隆抗体的晶体结构进行了解析,证实了DRVIA7为一种类VRC01抗体,将其与VRC01抗体结构进行比较发现,DRVIA7抗体的轻链N端和LCDR1区与gp120上的V5区和N276关键糖位处存在结构冲突,DRVIA7抗体与去糖基化gp120抗原的结合能力明显提升,实验证实该结构差异确实影响到了抗体的结合能力,解释了该抗体中和宽度有限的可能原因。在上述结构分析的指导下,我们通过基因改造删掉DRVIA7轻链N端两个氨基酸和替换VRC01 LCDR1区,拓宽了DRVIA7抗体的中和宽度,也证实了糖位对抗体中和能力的影响。改造抗体在Global Panel和DRVI Panel上的中和宽度分别为100%和72%,能够中和VRC01耐受的BJOX2000病毒。通过DRV1A7和VRC01抗体的轻重链交叉配对发现该抗体重链和轻链进化成熟不一致,重链具备了较强的中和能力,当与VRC01轻链配对时,抗体中和宽度与VRC01相当(Global Panel:100% vs. 92%, DRVI Panel:92% vs.96%),而且能够中和4个VRC01耐受的病毒(BJOX2000, DU172,57128,3817),但是轻链未完全进化,配对抗体的中和能力较弱。经与TSRI科学家合作,开展深度测序和生物信息学分析,对该感染者体内抗体组学进行系统的研究,同时我们对挑选出的抗体基因进行体外功能验证。分析发现DRVIA7-家系抗体基因在2006年之前开始出现,2008年达到高峰,2009年规模开始衰退。对于重链基因而言,2006年挑选出的前体基因已经具备了较强的中和能力(Global Panel:1.25 μg/ml,93%; DRVI Panel:0.84 μg/ml,86%),到2008年中和能力更强(Global Panel:0.92 μg/ml,90%; DRVI Panel:0.74 μg/ml, 92%),说明重链基因可以在2年的时间内快速成熟,2009年中和强度达到最高(Global Panel:0.54 μg/ml,98%; DRVI Panel:0.36 μg/ml,96%);对于轻链基因而言,2006年已经具备了VRCOl-like LCDR3特征,但是在2009年抗体基因库中仅发现一条具备较强中和能力的轻链(Global Panel:6.62 μg/ml,75%; DRVI Panel: 2.27 μg/ml,60%),说明机体没能完全跨越轻链成熟的障碍大量获得更高强度的中和抗体,但同时也说明了机体免疫系统确实也在通过进化尝试跨越这种障碍。通过感染者自身来源的轻重链配对获得了中和能力更强的抗体(Global Panel: 83% vs.33%)也证实了这一点,虽然配对抗体轻重链不一定来自同一个B细胞,但是说明机体自身免疫系统有可能进化出更强的广谱中和抗体。综上所述,本研究描述了细胞因子IL-21对HIV-1疫苗诱导细胞免疫的增强效应,为其作为一种佐剂应用于疫苗免疫提供了更多的临床前数据支持。本研究首次从中国HIV-1感染者体内分离得到了单克隆广谱中和抗体,证实gp120上关键糖位阻碍了抗体轻链的成熟,阐明该分枝抗体的发展成熟过程,一方面得到了一系列广谱中和能力强的单抗制剂,另一方面也为可诱导广谱中和抗体疫苗的免疫原设计提供了理论支持和设计思路,在设计靶向该位点的疫苗时应当考虑gp120上关键糖位,同时设计靶向激活该类抗体前体的疫苗可能诱导出广谱中和抗体。本研究在一定程度上推进了HIV-1疫苗在增强细胞免疫反应和诱导广谱中和抗体两个重要方向上的发展。