论文部分内容阅读
作为固着生物,植物的生长发育无时无刻不受到环境条件的影响,非生物逆境胁迫是影响农作物产量构成的重要因素之一。番茄是一种重要的食材和经济作物,同时也是进行遗传进化和分子生物学研究的模式植物,但番茄的生长发育容易受到不利环境条件的影响。为了揭示番茄对非生物胁迫的耐受机制,前人已经开展了相关的研究。HD-Zip I蛋白是植物所特有的转录因子家族HD-Zip的一个亚家族,其主要功能是参与植物生长发育调控以及对各种逆境胁迫作出响应。目前,关于HD-Zip I转录因子的功能研究在拟南芥、向日葵、水稻、玉米和番茄等作物中均已有相关报道。然而,番茄中与非生物逆境应答相关的HD-Zip I家族基因的功能研究则未见报道。番茄基因组测序的完成,为我们研究HD-Zip I家族基因的相关功能提供了极大便利。为了找出番茄中和非生物逆境胁迫相关的HD-Zip I转录因子,我们利用该家族蛋白的保守结构域对SGN数据库进行了搜索,通过SMART和NCBI在线软件对蛋白结构域进行分析后共鉴定出22条番茄HD-Zip I蛋白。根据进化分析及拟南芥同源基因研究结果,我们进一步从中筛选出四个HD-Zip I家族基因,即SlHB2-SlHB5。随后,我们对这四个基因开展了启动子结构分析、组织表达模式分析、激素处理和非生物胁迫处理的表达模式分析。结果表明,番茄SlHB2基因的启动子区域总共包含10种激素或胁迫相关的顺式作用元件。同时,该基因的转录水平受到外源激素SA、ABA、ACC和MeJA的诱导。此外,SlHB2基因在番茄的花和成熟叶中的表达水平相对较高,在幼叶、转色后4天（B+4）和7天（B+7）果实中的表达相对较低,在其它组织中的表达水平介于其间。SlHB3的启动子区共检测出8种顺式作用元件,外源激素ABA和MeJA均能显著诱导SlHB3基因的上调。SlHB3基因在转色期（B）至转色后7天（B+7）的果实中有较高的表达量,在其它组织中的表达水平相对较低。SlHB4基因的启动子区共包括9种顺式作用元件,ACC和Me JA能显著诱导其上调,SA和IAA仅能对该基因产生轻微的诱导作用。SlHB4基因在番茄的萼片、根和花中有着相对较高的表达量,在其它组织及果实发育时期中的表达量则相对较低。SlHB5基因启动子区仅检出6种顺式作用元件,外源激素ACC和MeJA能快速诱导该基因的上调,同时,IAA也能对SlHB5基因的表达产生轻微诱导。值得注意的是,包括脱水、盐、低温和机械伤害在内的非生物胁迫均能诱导四个HD-Zip I基因（SlHB2-SlHB5）不同程度的上调。根据表达模式分析及启动子结构预测结果,我们将SlHB2和SlHB3基因确定为后续基因功能探索的研究对象。为了揭示它们在番茄生长发育过程中（尤其是在番茄抵御非生物胁迫过程中）的相应功能,我们构建了SlHB2和SlHB3基因的RNAi载体。转基因研究结果发现,SlHB2基因表达水平的下降,导致番茄果实的果皮硬度降低,PG和PE等果壁代谢相关基因的表达水平上调,并最终导致成熟番茄果实的耐贮性减弱。此外,SlHB2基因表达水平的降低导致转基因番茄种子变小,粒重减轻。这说明SlHB2基因在番茄的果实及种子发育中发挥着一定的调控功能。由于SlHB2基因的表达受到多种外源激素和非生物胁迫的诱导,据此推测该基因可能在番茄抵御逆境胁迫中发挥着重要功能。干旱胁迫处理实验表明,SlHB2-RNAi番茄苗的干旱耐受能力明显提高。与此同时,转基因番茄叶片中的相对含水量（RWC）和叶绿素含量明显比野生型植株高,而相对失水速率（RWL）和丙二醛（MDA）含量低于野生型植株。定量PCR检测结果表明,脱水胁迫处理后,包括AREB、DREB、TAS14、Cat2、P5CS、APX1和APX2在内的胁迫相关基因在转基因株系叶片中的表达水平均高于野生型。种子萌发后番茄幼苗的抗盐胁迫实验表明,含有NaCl的MS培养基对沉默转基因番茄幼苗生长的抑制作用明显小于其对野生型的影响。此外,番茄离体叶片在NaCl溶液中的浸泡实验结果表明,SlHB2-RNAi株系叶片中叶绿素的降解速率显著低于野生型。同时,通过对番茄苗在高盐土壤中的生长表型观察发现,SlHB2-RNAi植株的盐胁迫耐受能力明显高于野生型。与此相符的是,盐胁迫处理后的转基因番茄叶片中含有比野生型更低的丙二醛含量及更高的叶绿素含量。定量PCR分析发现,沉默转基因株系的根系中,胁迫相关基因Cat1、Cat2、PR5、P5CS、APX1、TAS14、APX2、PR1、ER5和ERF1的表达水平明显比野生型高。另外,H2O2处理对SlHB2沉默株系生长的抑制作用明显比野生型小。以上这些结果表明番茄SlHB2基因的沉默导致胁迫相关基因的表达量出现上调,并由此提高了转基因番茄幼苗对干旱和高盐胁迫的耐受能力,说明SlHB2基因可能在番茄的干旱和盐等胁迫应答调控中发挥着负调控因子的作用。通过对SlHB3-RNAi株系的表型观察及果实成熟相关基因的检测,我们发现SlHB3基因的沉默并没有使番茄的生长发育过程产生明显的表型改变。同时,幼苗胁迫处理及种子萌发实验结果表明,与野生型相比,SlHB3-RNAi株系对干旱和盐胁迫的耐受能力也没有发生显著改变。这些结果说明SlHB3基因的沉默并不能影响番茄的上述生长发育过程及对逆境胁迫的耐受能力,于是我们推测番茄SlHB3转录因子与其同源蛋白间可能存在着功能冗余。由于同源蛋白的功能补偿作用,单独的SlHB3基因沉默并不能揭示其相应的调控功能。综上所述,我们对筛选出的四个HD-Zip I基因进行了表达模式分析和生物信息学分析,并对Sl HB2和SlHB3基因在番茄抵御非生物胁迫等过程中的相关功能进行了初步探索。本研究结果为全面揭示Sl HB2和SlHB3基因在番茄中的调控功能及番茄抗逆育种奠定了基础,同时也为以后的相关研究指明了方向。