食管鳞癌是一种具有中国特色的消化系统恶性肿瘤,起病隐匿、进展快。因此,阐明食管鳞癌发生发展的分子机制对食管鳞癌的诊治至关重要。肿瘤在进展过程中经历的癌基因突变、代谢需求增加、营养缺乏等多种内外环境压力的改变,引发内质网应激反应。为适应内质网应激,肿瘤细胞诱发非折叠蛋白反应,通过自噬、细胞重编程、上皮细胞-间充质转化（Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）等方式促进肿瘤的存活、转移和耐药。多项研究表明,靶向内质网应激的信号分子可有效治疗肿瘤,但内质网应激是否在食管鳞癌进展中发挥关键作用及相关机制仍不明确。在本研究中,我们通过血清饥饿使食管鳞癌细胞系KYSE450处于内质网应激状态并进行转录组测序,筛选并验证TMTC3在处于内质网应激状态的细胞中高表达。在本实验室86对食管鳞癌组织转录组测序结果中,TMTC3 mRNA在癌组织中的表达显著高于癌旁组织。75对食管鳞癌组织芯片的免疫组化结果显示,TMTC3蛋白在癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。临床资料分析发现,TMTC3高表达与食管鳞癌患者的不良预后正相关。结合TCGA可视化数据库分析发现TMTC3在食管鳞癌、肺鳞癌、头颈鳞癌中异常高表达,具有一定的鳞癌特异性,通过ChIP实验和双荧光素酶报告基因实验证实TMTC3基因的转录受鳞癌特异性转录因子TP63调控。体外细胞功能实验结果表明,敲降TMTC3可抑制食管鳞癌细胞的增殖、侵袭及迁移。动物实验研究TMTC3在体内对食管鳞癌的作用,裸鼠皮下成瘤实验表明,低表达TMTC3的食管鳞癌细胞裸鼠皮下瘤的生长速度显著低于对照组;裸鼠尾静脉注射实验结果显示,低表达TMTC3的食管鳞癌细胞发生肺转移显著低于对照组,同时可见肝转移及淋巴结转移也显著低于对照组。因TMTC3定位于内质网并参与内质网应激反应,我们首先通过免疫荧光实验确定TMTC3与内质网应激感受器及内质网伴侣分子GRP78存在共定位;进一步通过免疫共沉淀实验发现,TMTC3通过竞争性结合GRP78导致其与内质网应激相关因子PERK解离,导致PERK信号通路激活并促进ATF4入核发挥转录因子的作用。转录组测序分析稳定敲降TMTC3后,食管鳞癌细胞内下游分子的变化。结果表明,TMTC3可正向调控FAM3C的mRNA和蛋白水平,且染色质免疫共沉淀实验结合双荧光素酶报告基因实验证实ATF4可促进FAM3C基因的转录激活,数据库分析结果显示二者表达显著正相关。后续研究结果表明,TMTC3可通过FAM3C 调控 EMT 相关标志物 E-cadherin、N-cadherin 和 Vimentin 的表达。综上所述,受鳞癌特异性转录因子TP63调控的TMTC3在内质网应激过程中表达升高,可促进GRP78和PERK的解离,促进PERK信号通路中ATF4的核转位,激活FAM3C基因转录从而上调其表达,最终导致食管鳞癌的恶性进展。本研究可为研究食管鳞癌进展的分子机制提供新思路,且TMTC3有望成为食管鳞癌诊治的新靶点。由于食管鳞癌患者对化疗不敏感、易产生耐药,导致化疗失败、肿瘤复发。因此,阐述食管鳞癌的耐药机制、寻找增强化疗敏感性的靶点尤为重要。ABC转运蛋白超家族参与多种生理过程,与肿瘤的多药耐药密切相关。目前该家族中的ABCB1、ABCC1和ABCG2的作用机制相对比较明确,已有相应的靶向药物应用于临床,但该家族成员是否参与食管鳞癌的多药耐药、是否可作为食管鳞癌耐药的治疗靶点仍有待研究。基于本实验室前期86例食管鳞癌转录组测序并结合TCGA可视化数据库分析发现ABC-X在食管鳞癌中异常高表达,且具有鳞癌特异性,其高表达与基因拷贝数扩增无关,但与鳞癌特异性扩增的转录因子TP63和SOX2正相关。通过JASPAR数据库预测TP63、SOX2与ABC-X启动子区的结合位点,进一步通过ChIP实验和双荧光素酶报告基因实验证实TP63、SOX2可与ABC-X的启动子区结合并促进其转录。在食管鳞癌细胞中敲降TP63或SOX2,ABC-X的mRNA表达发生相应下调。以上结果表明,TP63和SOX2转录激活ABC-X基因的表达是ABC-X在鳞癌（食管鳞癌）中特异性高表达的原因之一。通过免疫荧光实验观察ABC-X在细胞内的亚定位,发现ABC-X与溶酶体标志物LAMP2有显著共定位,表明ABC-X定位于溶酶体。细胞功能实验结果表明,在食管鳞癌细胞中敲降ABC-X能明显抑制细胞的增殖能力,但不影响其侵袭迁移能力。顺铂处理敲降ABC-X的食管鳞癌细胞检测细胞凋亡情况,结果表明敲降组细胞的生长在加入顺铂后受到明显抑制,细胞凋亡的数量明显增加,促凋亡相关蛋白的表达上调。构建稳定敲降ABC-X的食管鳞癌细胞进行皮下成瘤,结果显示,低表达ABC-X的食管鳞癌细胞皮下成瘤能力显著降低。此外,对ABC-X在食管鳞癌中的作用机制进行了初步探索,利用稳定敲降ABC-X的细胞系进行全质谱分析,筛选得到对照组/实验组比值小于0.6的蛋白共501个,并对这些差异蛋白进行GO和Pathway富集分析,结果提示ABC-X的功能与膜结构运输相关。前期研究表明ABC-X在食管鳞癌耐药中发挥重要作用,有望成为食管鳞癌耐药患者新的治疗靶点。为了获得针对ABC-X的小分子化合物,我们根据ABC-X的氨基酸序列进行同源建模,与经FDA批准的1953种小分子化合物进行分子对接,根据结合打分值筛选得到41种小分子化合物。将上述41种小分子化合物分别处理食管鳞癌细胞,并通过ELISA检测ABC-X的表达,取相对表达量低于0.7的5种小分子化合物进行RTCA细胞增殖实验,最终确定一种可明显抑制食管鳞癌细胞增殖的小分子化合物,且这种小分子化合物可增强食管鳞癌细胞对顺铂的敏感性。综上所述,ABC-X有望成为食管鳞癌治疗的新靶点,但其作用的分子机制有待进一步探讨,而针对ABC-X的小分子化合物联合顺铂有望为食管鳞癌化疗抵抗的患者提供新的治疗策略。