目的 脊髓损伤是一类严重威胁人类健康的创伤，目前尚无有效的治疗方法。已知脊髓损伤修复过程中神经再生、再次髓鞘形成和死亡神经元的替代都需要面对胶质瘢痕及复杂的不利于神经再生的内环境，现已证实胶质瘢痕能抑制轴索生长和髓鞘形成。胶质瘢痕最主要成分是星形胶质细胞，因此某些实验策略为通过抑制胶质细胞增殖而促进神经再生。肝细胞生长因子(HGF)具有抑制瘢痕的作用。本研究将腺病毒介导的肝细胞生长因子转染体外培养的星形胶质细胞，并对该细胞进行划伤以模拟体内损伤，观察HGF对星形胶质细胞增殖的影响。方法和结果(1) 在转染有绿色荧光蛋白基因的新生大鼠脊髓原代培养星形胶质细胞中，观察到腺病毒对胶质细胞的转染率较高。以相应的Ad-HGF转染该细胞后在培养液上清中有HGF表达。用间隔3mm的纵横平行线为模板对用6孔板培养的该细胞进行划伤，制备体外损伤模型。通过检测星形胶质细胞特征性蛋白胶质纤维酸性蛋白含量和细胞周期中S期比例，观察转染Ad-HGF的细胞在划伤后不同时间点细胞增殖情况。结果发现Ad-HGF在细胞划伤后第一天对增殖有明显抑制作用：(2) 3H掺入法观察HGF蛋白对正常培养的星形胶质细胞的作用，发现HGF对正常培养的胶质细胞无明显作用；(3) 细胞划伤后用HGF蛋白作用30min，通过检测促分裂原活化蛋白激酶(P42／414 MAPK)中表达和-磷酸鞘氨醇(SPP)，途径中关键酶SPK水平，观察这两条对细胞增殖相关的信号途径，发现P42／44 MAPK这条途径在胶质细胞中活性很高，显示可能对其生理功能有重要作用，但并没有因HGF蛋白作用而增强。而SPK却在HGF蛋白低剂量作用下高表达，高剂量时表达下降，说明HGF对其可能有双重作用：(4) 通过不同剂量HGF蛋白对星形胶质细胞损伤后的影响，进一步阐明HGF对损伤后星形胶质细胞增殖的作用。结论 肝细胞生长因子对正常生长的星形胶质细胞无作用，而对划伤的星形胶质细胞的增殖具有双重作用，在低剂量是促进、高剂量时抑制增殖，SPP信号途博士论文----一中文摘要径在其中发挥作用。第二部分肝细胞生长因子对脊髓神经再生的实验研究 目的治疗脊髓损伤的关键是促进神经再生，尽管目前还未彻底了解神经轴索的再生机制，但研究表明，合适的微环境可以促进中枢神经再生。基因治疗脊髓损伤的策略就是通过转基因技术提供一种合适的微环境，而目前主要是向局部提供神经营养因子。神经系统中HGF广泛存在，且在大鼠发育的不同阶段，在大脑不同部位HGF及受体表达量均有差异，提示其对大脑皮层神经元的分化、运动、存活和神经发生上起作用。此外还观察到它对体外培养的皮层神经细胞有营养和保护作用。迄今没有HGF对中枢神经再生作用的报道，本研究通过观察HGF蛋白对体外培养脊髓神经组织离断突起的作用，证实HGF能促进神经再生，并在体内通过Ad一HGF转染进一步证实其能促进皮质脊髓束的再生，为其在脊髓损伤中的应用，奠定一定的理论基础。 方法和结果(l)建立一种体外观察神经再生的方法:首先铺鼠尾胶原，然后接种胚鼠脊髓组织块，待5天后在发出突起部位约100一150um处将长出的突起离断，于离断远端去除一块鼠尾胶原并重新铺胶，待胶固化后添加培养基，在原位观察神经再生;(2)用建立的组织快模型观察HGF蛋白对神经再生的作用。重新铺胶后换成N:条件培养基，24h:后通过观察再生突起的长度判断再生情况。结果证实HGF对神经再生有促进作用;(3)体内进行Ad一GFP转染。通过冰冻切片观察转染效果，发现在转染后1一2周时绿色荧光表达最强，直到第8周仍有表达;(4)脊髓内转染Ad一HGF，并于转染同时进行脊髓左侧部分，背测2/3部分离断，2个月后通过生物胞素顺行示踪观察皮质脊髓束再生状况，进一步证实HGF对神经再生有促进作用。 结论建立了一种原位观察神经突起再生的方法，在此基础上证实肝细胞生长因子体外能促进脊髓组织神经突起再生，体内能促进皮质脊髓束再生。