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共轭亚油酸(Conjugated Linoleic Acid,CLA)是一类具有不同位置和几何异构体的十八碳二烯酸的总称。CLA因结构多样而具有不同的生理功能,目前研究较多的活性异构体为c9,t11-CLA和t10,c12-CLA。生物合成法利用亚油酸异构酶催化LA生成不同类型的CLA,因其产物结构单一、安全性更高而受到研究人员的青睐,但是亚油酸异构酶催化能力仍有待提高。本研究以发酵乳中分离的植物乳杆菌和市售痤疮丙酸杆菌基因组为模板,克隆表达植物乳杆菌的肌球蛋白交叉反应抗原基因(Myosin-Cross-Reactive Antigen,mcra)和痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶基因(linoleic acid isomerase gene,lai),利用易错PCR突变两种基因,获得吸光度值和CLA产量可能提高的菌株,通过流式细胞术筛选携带绿色荧光蛋白标签的重组菌,快速得到正突变子,对部分提高显著的突变株测序,分析突变前后的亚油酸异构酶基因,探究差异位点对产量的影响。从五份内蒙古传统发酵乳中筛选鉴定到10菌株,选择CLA产量较高的植物乳杆菌HAC01,测定其发酵性能,利用均匀设计优化发酵条件为接种量4%,LA添加量为0.7mg/mL,在pH 6.5、37℃条件下发酵32 h,4℃后熟12 h。克隆植物乳杆菌的mcra和痤疮丙酸杆菌的lai:lai-pl(ORF1695bp)和lai-p(ORF1275bp),经测序比对,与相应菌株的基因相似性为100%,且无氨基酸序列突变,说明克隆成功。将两种基因分别与pCold-SUMO可溶性原核表达载体连接,转化表达于大肠杆菌,lai-pl基因表达分子蛋白大小约70 kDa,lai-p基因表达分子蛋白大小约55 kDa。利用易错PCR技术突变lai-pl和lai-p,连接绿色荧光蛋白基因gfp,构建标签表达载体pCold-gfp-yclai-pl和pCold-gfp-yclai-p,结合流式细胞术筛选正突变菌株,在282株pCold-gfp-yclai-pl重组菌中,吸光度值提高的菌株有243株,提高率86.2%,其中提高最多的为155号菌,突变前吸光度值为0.1746±0.0002,突变后达到1.0506±0.0004,产量提高了6.02倍;174株pCold-gfp-yclai-p重组菌中,CLA产量提高的菌株有156株,提高率89.6%,其中产量最高的为39号菌,突变前CLA产量为2.9137±0.0000μg/mL,突变后达到11.6186±0.0036μg/mL,产量提高了3.99倍。对pCold-gfp-yclai-pl重组菌测序后得到完整序列的菌株为53号,该菌株的氨基酸突变位点为Y-C(69位)、L-P(77位)、F-L(174位)和N-S(486位),生物学信息分析推测亚油酸异构酶系MCRA蛋白催化产物量提高与38-69氨基酸位的构型变化有关,69位的氨基酸突变为亚油酸异构酶系mcra的有益突变位点。本文对吸光度值提高的菌株进行了MCRA相关蛋白的一级、二级和三级结构的生物信息学分析,为进一步阐释亚油酸异构酶的作用机理和定点突变提高CLA产量提供理论依据。