金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是目前下呼吸道感染常见的革兰阳性球菌,其致病机制与其能分泌多种胞外酶和外毒素有关,它可以引起多个器官组织感染,并有较高的发病率和死亡率[1,2]。近年来,由于其感染率的上升、产生耐药速度的加快以及其易于从急性感染向慢性、持久性、复发性感染转变等特点,金黄色葡萄球菌导致的感染逐渐成为人们关注的焦点。其附属基因调节子(accessory gene regulator, agr)是一种重要的密度感应(quorum sensing,QS)信号系统和毒力因子调节系统,参与金黄色葡萄球菌生物膜(biofilm,BF)的形成与分散(dispersion)以及毒力因子(virulence factor)的表达调控[3-5]。许多研究表明金葡菌agr系统是在毒力因子调节过程中起中心作用的密度感应系统。AgrC是金葡菌二元信号系统中的信号转导因子,它是一个受体组氨酸蛋白激酶,包含一个氨基酸的跨膜区和一个细胞内的组氨酸蛋白激酶域,能够被同源或非同源自诱导肽(autoinducing peptides,AIPs)激活或抑制[6,7]。AgrC属于比较罕见的组氨酸蛋白激酶亚科,包括5-6个跨膜片段。AgrC通过对AIP的特异识别,激活蛋白激酶胞内域部分活性,诱导转录操纵子RNAII和RNAIII的转录,从而调控agr系统,在agr调节系统中对毒力调节起到关键作用[8]。由于抗生素的广泛使用,使多数细菌产生了抗药性,因此,应用传统的筛选方法获得具有新型抗菌机制的抗生素越来越困难。研究发现一些群体感应信号分子类似物能够抑制致病因子的生成或葡萄球菌的生长[9,10],因此通过干扰QS系统而减少金黄色葡萄球菌毒素、致病因子表达及生物膜形成,已成为预防和治疗金葡菌感染的新的突破口,为解决传统抗生素耐药问题提供了新的靶点[11,12]。因此,发现可以与agrC特异性结合的短肽,阻断agr系统活化,以agrC作为治疗金葡菌感染的靶分子,从而减轻或抑制金葡菌毒力因子产生,达到控制金葡菌感染的目的具有重要意义。近年来,以噬菌体展示(phage display)技术筛选肽类药物的蓬勃发展为金葡菌感染的防治提供了新的思路。噬菌体展示技术的原理是将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达,融合蛋白展示在噬菌体表面,而编码这个融合子的DNA则位于该噬菌体内。噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系,使各种靶分子的多肽配体通过淘洗(panning)得以快速鉴定。本实验拟利用噬菌体展示肽库技术,筛选可与agrC特异结合的小分子多肽,并研究它们对金葡菌毒力和生物膜形成能力的影响。研究方法:1、构建金黄色葡萄球菌N315标准株agrC的原核表达质粒pET28α(+)-agrC,经测序鉴定后转化大肠杆菌,IPTG诱导后,SDS-PAGE鉴定agrC融合蛋白的表达,磁珠分选纯化法获得纯化的agrC蛋白。2、采用经典的亲和富集法对噬菌体12肽库进行4轮亲和筛选,以agrC为靶分子,经过4轮筛选,获得可与agrC特异性结合的阳性噬菌体克隆。ELISA实验进一步确证。3、通过ELISA法对筛选出来的克隆进行鉴定,获得能与agrC特异性结合的阳性噬菌体克隆,将获得的阳性噬菌体克隆进行DNA测序,根据噬菌体克隆基因所插入的外源DNA序列推导出呈现的外源多肽氨基酸序列。应用Blast软件将多肽序列与agrC的一级结构序列进行比较分析。4、检测阳性克隆噬菌体与agrC的亲和力及其剂量依赖性,筛选出亲和力最高的阳性克隆噬菌体。5、人工合成筛选得到agrC结合多肽,观察其对金葡菌生物膜形成能力的影响及其对生物膜形成相关基因和毒素分泌的影响。研究结果:1、重组克隆PAT2-agrC经测序鉴定与GenBank上金葡菌N315株的agrC核苷酸序列一致性为98.0%,氨基酸序列一致性为98.5%。SDS-PAGE结果表明,重组质粒pET28α(+)-agrC在大肠杆菌中成功表达,磁珠分选系统有效纯化了目的蛋白。2、采用亲和筛选法,以agrC为靶分子,经过4轮筛选,从噬菌体12肽库中获得了可与agrC特异结合的噬菌体克隆。3、从上述获得的噬菌体克隆中随机挑取60个噬菌体克隆进行扩增和纯化,发现22个克隆与agrC结合力显著强于对照组。提示它们与agrC结合可能是特异的。4、将这些阳性克隆进行DNA序列分析及氨基酸序列推导,发现5个不同的DNA序列,其中3个有共同的核心序列,这些克隆的核心序列为(XX)L(X)Q(XX)L(XX)L(X)。5、人工合成agrC结合多肽N1、N2、N4及无关多肽N0,观察到N1在细菌生物膜的粘附、聚集期对金葡菌N315及ATCC25923生物膜形成能力有明显抑制效应;N1多肽还能影响生物膜相关粘附聚集因子atlE和ica转录水平及其蛋白表达,同时N1可以减少N315菌株TSST-1毒素的分泌。而N0、N2、N4对生物膜形成能力及其相关因子没有明显影响。经ELISA检测证实N1是与agrC结合力最高的特异性多肽,其氨基酸序列为CRLEQERLSPLI。结论:1、本实验获得了agrC蛋白的表达与纯化。2、从噬菌体随机12肽库中筛选获得了22个可与agrC特异结合的噬菌体克隆,经DNA序列分析及氨基酸序列推导,发现5个不同的氨基酸序列,其中3个有共同的核心序列,这些克隆的核心序列为(XX)L(X)Q(XX)L(XX)L(X)。ELISA检测发现N1是与agrC结合力最高的多肽,其氨基酸序列为CRLEQERLSPLI。3、人工合成N1多肽能显著抑制金葡菌生物膜形成能力、降低生物膜相关结构基因的活性、减少金葡菌毒素分泌作用。4、N1多肽用于预防和治疗早期金葡菌生物膜相关感染可能更为有效,对分化成熟期生物膜的抑制效果不明显。上述研究结果对于阐明agrC对金葡菌毒力和生物膜形成的调节作用,设计以agrC为靶分子的抗金葡菌多肽提供了有力的实验依据,为金葡菌生物膜感染的治疗提供了新型候选制剂。