本文在如何提高拯救效率，提高下游基因的转录水平，方便外源基因引入等方面进行了探索，并对重组有外源基因的麻疹病毒全基因组感染性克隆进行拯救。构建了适合麻疹病毒感染的Vero细胞T7 RNA聚合酶稳定表达细胞系，用以启动麻疹病毒全基因组的转录并与常用的痘苗病毒表达系统进行比较分析。 置于T7启动子控制下的全基因组质粒的转录水平受到很多因素影响，鸟嘌呤是其中的一个重要影响因素。构建了麻疹病毒微复制子并以其为模型来研究如何提高病毒的拯救效率。首先对鸟嘌呤和锤头状核酶对转录水平的影响进行比较分析，在麻疹病毒微复制子质粒的基础上，构建了含有3个鸟嘌呤(G)和锤头状核酶(HamRz)的PminiEGFP3G、2个G和HamRz的PminiEGFP2G、不含G只含HamRz的PminiEGFPOG和含有3个G但不含HamRz的PminiEGFP3G一共4个质粒。拯救后通过荧光分析和FACS分析对4个质粒的拯救效率进行比较，结果表明，PminiEGFP3G的拯救效率最高，而PminiEGFPOG的拯救效率比较低，PminiEGFP3G-质粒由于与副粘病毒科6的倍数原则相违背，拯救效率最差。可见，鸟嘌呤对微复制子质粒的拯救效率有影响，3个鸟嘌呤与锤头状核酶的结合是提高微复制子质粒拯救效率的最佳组合。针对鸟嘌呤对麻疹病毒拯救效率的影响进行了研究，为以T7启动子为基础的单股负链RNA病毒的拯救进行了有益的探索。 MV病毒全基因组的转录是在T7启动子的控制下，产生的负链基因组与病毒结构蛋白N、P、L形成RNP后，充当RNA合成的模板。但是在真核细胞中不具有T7RNA聚合酶，转录过程的实现必须通过外源来提供聚合酶。构建了一株稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系(Vero/pcDNA3-T7)，用于麻疹病毒的拯救过程。经免疫印迹实验表明在无选择压力情况下，连续传40代(约120天)T7 RNA聚合酶基因在vero细胞中可以稳定表达。将T7启动子控制下含有报告基因(EGFP)的表达质粒pT7IP-EGFP转染细胞后，绿色荧光蛋白能够表达，表明表达出的蛋白具有聚合酶的活性，能够驱动T7启动子下游基因的表达。将反向插入报告基因的微复制子质粒PminiEGFP转染已经感染过麻疹病毒CC-47株的细胞Vero/pcDNA3-T7，细胞株中能够检测到报告基因的表达，与痘苗病毒-T7载体系统相比报告基因的拯救量增加，并且细胞无明显死亡，显示了拯救方法的优越性。 麻疹病毒基因的转录起始于病毒基因组的3’端，聚合酶沿着基因起始(GS)和基因结束(GE)信号序列顺序依次进行转录，每经过一个基因转录水平就会明显下降。对本实验室前期构建的麻疹病毒全基因克隆进行进一步优化和修饰。首先将麻疹病毒N-P基因间结构类似的GS和GE信号序列，插入到麻疹病毒基因组结构基因P和M之间非必须区域，命名为NPaigr结构，并在GS和GE之间引入多克隆位点以利于外源基因的引入。为验证合成的NPaigr结构是否具有驱动外源基因表达的功能，在麻疹病毒微复制子质粒的基础上构建双顺反子质粒pMVaigrEGFP/HTNS，其结构为：启动子-HamRz-MV 5’Trailor-反向EGFP-NPaigr-反向汉滩病毒核蛋白基因(HTNS)-MV 3’Leader-HdvRz。结果表明，在MV预先感染的Vero/pcDNA3-T7细胞中，报告基因绿色荧光蛋白能够表达，说明NPaigr结构能够驱动其下游的基因表达。然后将NPaigr结构克隆到MV全基因组克隆中，将汉滩病毒84FLi的核蛋白的编码区和报告基因EGFP分别插入到麻疹病毒全基因组表达载体的多克隆位点，构建成两个重组麻疹病毒载体表达质粒pRz8F7Raigr-HTNS和pRz8F7Raigr-EGFP，同时保证了插入后麻疹病毒全基因组碱基数是6的倍数。将上述2个质粒分别与辅助质粒麻疹病毒结构蛋白表达质粒pcDNA3-N、pcDNA3-P及pGEM3zf-L共转染T7RNA聚合酶稳定表达Vero细胞系Vero/pcDNA3-T7，经过细胞传代进行麻疹病毒重组全基因组感染性克隆的拯救试验。在第二代细胞中经过ELISA、免疫荧光、RT-PCR以及序列测定突变标签等方法鉴定有麻疹病毒的存在，但是可以稳定传代的感染性克隆获得尚需进一步的优化和探索。本研究对构建的各种因素进行了比较研究，明显提高了MV微复制子质粒的拯救效率，并以此为基础对MV全基因组克隆进行了修饰，同时对全基因组克隆中外源基因引入进行了有益的探索，外源基因在细胞中能够得到有效的表达，为麻疹病毒载体的研究作了准备，为应用病毒载体进行传染病防治和肿瘤治疗等方面打下了基础。