胃癌是目前人类最常见的恶性肿瘤,其死亡率占肿瘤相关死亡率的第二位。在我国,胃癌发病率高,预后差,导致胃癌患者死亡的主要原因是术后发生侵袭转移,因此研究胃癌侵袭转移的相关分子及其分子机制具有重要的理论价值和临床意义。恶性肿瘤侵袭转移的发生发展过程是一个复杂的生物学过程,包括肿瘤细胞从原发性病灶处分离,侵入周围组织,穿透基底膜进入血管和淋巴管,渗出血管和淋巴管,重新形成转移结节进而增殖成新的转移灶,在此过程中上皮间质转变(EMT)和间质上皮转变(MET)起到了关键的作用。EMT在胚胎发育过程中被发现,后来在众多肿瘤转移过程中也发现EMT的发生。EMT在正常胚胎发育过程中是受到时间和空间上严密调控的生物学过程,但在肿瘤中EMT的失调导致了上皮细胞失去了应有表型,获得了间质细胞的特性,从而引起了肿瘤细胞的侵袭转移,此过程中上皮标志性分子钙粘蛋白E-cadherin表达降低,间质标志性分子波形蛋白Vimentin表达上升。临床上胃癌发展过程中极易发生侵袭和转移,治疗和预后情况极差,所以研究胃癌侵袭转移及EMT的相关分子机制是诊断和治疗胃癌的重要基础。RUNX3是RUNX蛋白家族成员之一,RUNX3在胚胎发育过程中主要参与胃肠道的发育,神经发生等活动,近些年来研究发现RUNX3表达异常与胃癌的发生发展密切相关。Qing-Lin Li等发现RUNX3可以通过对胃粘膜上皮细胞增殖的抑制,促进胃粘膜上皮细胞凋亡和细胞周期的停滞来调控胃粘膜上皮细胞的生长。临床研究显示：RUNX3也与胃癌的侵袭转移有关,但关于RUNX3影响胃癌侵袭转移的分子机制还不完全清楚,RUNX3能否通过调控EMT影响胃癌的侵袭转移目前还未见报道。本研究探讨了肿瘤抑制因子RUNX3对人胃癌细胞EMT的影响及分子调控机制。第一部分：RUNX3对人胃癌细胞侵袭转移的影响目的：探讨RUNX3对人胃癌细胞BGC823及SGC7901侵袭转移的影响。方法：将RUNX3的真核表达质粒转染人胃癌细胞SGC7901及BGC82348h后,—部分细胞提RNA和蛋白,做QRT-PCR和Western blotting.另一部分细胞消化、计数,小室预铺matrigel胶,取五万个细胞加入Transwell小室的上层,下层加入NTH3T3细胞培养液,24小时后,移去上层未侵袭的细胞,穿过的细胞甲醇固定后结晶紫染色并细胞计数。结果：QRT-PCR和Western blotting显示在人胃癌细胞BGC823和SGC7901中RUNX3基因显著高表达,Transwell实验中RUNX3高表达组相对于对照组侵袭到下层的细胞数显著性减少。结论：转染后RUNX3真核表达质粒成功高表达RUNX3蛋白。Transwell实验表明在胃癌细胞系中高表达RUNX3组相对于对照组可以明显抑制细胞的侵袭转移性。第二部分：RUNX3对EMT相关基因表达的调控目的：探讨RUNX3对EMT相关基因E-cadherin.Vimentin.Snail及Twist表达的影响。方法：将RUNX3的表达质粒转染人胃癌细胞,提取RNA,反转录cDNA和提取蛋白,Western blotting及RT-PCR、QRT-PCR检测RUNX3对E-cadherin. Vimentin.Snail及Twist表达的影响,稳定特异性siRNA干扰RUNX3的表达72小时后,检测E-cadherin及Vimentin的表达。结果：RUNX3表达质粒转染胃癌细胞SGC7901后,Western blotting显示E-cadherin的蛋白水平有所升高,但不太明显,Vimentin的蛋白水平显著降低。将RUNX3用siRNA干扰后,Vimentin的蛋白水平明显升高,RT-PCR和QRT-PCR检测结果发现Runx3对E-cadherin和Vimentin的RNA水平没有显著影响。高表达RUNX3后Snail和Twist等调控EMT的转录因子在蛋白和RNA水平上均没有什么变化。结论：高表达RUNX3只在蛋白水平上能够轻微升高E-cadherin的表达,显著抑制Vimentin的表达,沉默RUNX3后Vimentin显著升高,但是RUNX3对EMT的调控作用与Snail和Twist等转录因子的调控无关,并且是一种转录后调控的作用方式。第三部分：Runx3调控Vimentin基因表达的分子机制目的：探讨RUNX3对Vimentin基因的表达进行转录后调控的分子机制方法：转染RLNX3表达质粒后42h后,加入10μM的MG-132,作用6h后,提取蛋白,Western boltting检测Vimentin表达的情况,另外转染RUNX3表达质粒后做microRNA基因芯片筛查,对筛查结果进行查阅文献和microRNA数据库比对分析。结果：加入蛋白酶体抑制剂MG-132后Vimentin的表达水平并没有恢复。microRNA芯片结果显示RUNX3可以显著上调miR-30a的表达,查阅文献和microRNA数据库发现miR-30a可以不完全互补结合在Vimentin基因的3’-UTR区,抑制Vimentin蛋白的翻译过程。结论：Runx3调控Vimentin的表达不是通过泛素-蛋白酶体途径实现的,芯片结果显示RUNX3可以上调miR-30a的表达,数据库和文献显示miR-30a可以抑制Vimentin蛋白的转录后表达,从而说明RUNX3可以在转录后水平抑制Vimentin蛋白的表达。第四部分：RUNX3通过miR-30a调控Vimentin基因表达影响EMT的发生目的：验证RUNX3通过上调miR-30a从而抑制Vimentin基因的转录后表达这一分子机制。方法：转染RUNX3表达质粒48h和siRNA干扰RUNX372h后,Trizol法提取RNA反转录成cDNA,QRT-PCR检测miR-30家族的表达情况,miR-30家族mimics转染胃癌细胞后提取蛋白,Western boltting检测Vimentin表达的情况。通过分子克隆构建了Vimentin的mRNA的3’UTR的荧光素酶报告质粒的野生型和突变型pMIR-Vimentin3’UTR, pMIR-Vimentin3’UTR MUT1和pMIR-Vimentin3’UTR MUT2,转染miR-30a24h后转染报告质粒,48h后进行荧光素酶检测。结果：QRT-PCR结果证实：高表达RUNX3确实可以显著升高miR-30a的水平,干扰RUNX3表达可以抑制miR-30a的表达。RUNX3的变化对miR-30e没有显著性影响。miR-30a mimics转染胃癌细胞后Vimentin的表达水平显著降低,和转染RUNX3表达质粒的效果一致。miR-30e对Vimentin蛋白表达没有影响。荧光素酶实验显示相对于转染miR-1011,野生型和Mutl突变报告系统中转染miR-30a荧光素酶表达值降低,Mut2突变报告系统中转染miR-30a荧光素酶值恢复到对照组的水平。结论：RUNX3确实可以显著正性调控miR-30a的表达,但对miR-30e的调控不明显,miR-30a可以靶向结合到Vimentin的3’UTR上的第二个结合位点上,抑制Vimentin的mRNA的翻译,降低Vimentin蛋白的表达。肿瘤抑制因子RUNX3影响EMT的分子机制是RUNX3可以上调miR-30a的表达从而间接抑制了Vimentin的表达水平。研究创新性和意义肿瘤抑制因子RUNX3与恶性肿瘤的转移有密切相关性,本研究在细胞水平上首次揭示了在人胃癌细胞中RUNX3可以影响转移过程中的上皮间质转变(EMT)现象,并且证明RUNX3可以通过上调miR-30a的表达,miR-30a又通过靶向结合Vimentin的3’UTR,从而抑制EMT中关键的间质标志分子Vimentin的表达,从而起到抑制EMT的发生和胃癌细胞侵袭转移的作用。通过此研究在RUNX3与EMT之间的关系上发现一个重要通路,并且在分子标志物方面对于胃癌的临床诊断和治疗提供重要的分子基础。