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cC1是孙树汉教授利用免疫筛选的方法，从猪囊尾蚴（Cysticercus cellulosae）cDNA文库中分离到的一个抗原基因。大量的研究证明，cC1不仅是一个重要的保护性抗原，而且可能参与了囊尾蚴细胞丝裂原信号传导途径，对于细胞的生长、分化具有重要的生理意义。为进一步探讨cC1的生理功能，首先利用生物信息学（bioinformatics）软件对cC1进行了序列分析、二、三级结构预测和基本理化特性预测。通过核酸水平和氨基酸水平的相似性搜索，发现cC1同膜联蛋白家族（Annexin family）成员的序列相似性达到了40～60％。一般认为，当两个基因的序列相似性大于30％，那么这两个基因就可能是同源基因。因此，cC1可能同Annexin基因同源；进一步利用多个蛋白质结构域数据库进行分析，发现cC1氨基酸序列中具有四个典型的Annexin重复区域。每个重复区域由70～100个氨基酸残基组成，包含一个"M-K／R-G-X-G-T-（38residues）-D／E”的基序；对cC1的二级结构进行预测，发现该蛋白以α-螺旋为主，占氨基酸总数的57.8％。基本没有β-折叠出现；利用同源建模（homology modeling）预测cC1的三级结构，发现cC1同Annexin A5具有相似的拓扑结构。这些预测和分析均表明，cC1具有Annexin蛋白典型的结构特征，因此很可能是Annexin家族的一个新成员。 Annexin家族是在真核生物中广泛存在、具有重要生理功能的一类钙结合蛋白。因其在Ca2+存在的情况下能够和酸性磷脂结合，所以又称为钙依赖性磷脂结合蛋白（calcium-dependent phospholipid binding proteins）。将cC1编码序列克隆到原核表达载体pGEX-5T中，转化大肠杆菌k802，在IPTG诱导下表达，得到GST融合蛋白。利用磷脂共沉淀法证明该融合蛋白在2mMCa2+浓度时，能够和含磷脂酰丝氨酸的脂质体结合，而且这种结合是可逆性的，加入钙离子螯合剂EGTA后能够和膜分离。以上结果说明，cC1具有Annexin基因的典型结构特征，同时也具有Annexin蛋白所共有的生物学活性，因此属于Annexin家族。同时，由于cC1同现有Annexin基因C端保守区域的同源性均低于60％，N 博士学位论文 中 文 摘 要端同源性低于 20％；因止匕北 不属于任何一个已知的 Annexin亚家族，而是一个新的 Annexin亚家族成员。根据新的 Annexin命名规则，cCIN该属于B类Annexin基虬 所以命名为Annexin BI 简写为AnxBI AnxBI 是局形动物（platyhelminth）中首次被鉴足的一个 Annexi。。成员，研究它的生理功能，不仅可以了解AnxBI对于猪囊尾拗的寄生、移行、生长、发育等生命活动中的重要意义。为治疗和预防该类疾病提供新的药物靶点，而且可以将猪囊尾蝴作为一种结构简单的模式生物，研究Annexin在高等真核生物中的生理功能以及分子进化。所以接下来我们对AflXBI 的生理功能作了初步的探讨。利用 盯－PCR技术研究Annexin BI在 TS。。i。son删不同发育阶段的表达；发现 A。Xf是囊尾拗阶段特异性表达的基民 可能与囊尾拗的生长、发育和变态有关；研究中还发现；重组蛋白GST个 能够显著延长部分激活的凝血活酶时间（KPTT），因而具有很强的抗凝血活性，该凝血活性可能与AnxBI结构中四个Ca’”依赖性磷脂结合位点和两个“K－G－D”序列有关：在血液凝固过程中需要血小板的激活，以形成一个以磷脂酞丝氨酸（PS）为主的磷脂膜催化表面，使凝血因子X、凝血酶原等凝血固子活化。由于膜联蛋白具有较强的钙依赖性磷脂结合活性，因而能够竞争性抑制凝血因子和血小板膜磷脂的结合，从而抑制了凝血因子X等的活化，起到抗凝血的作用。 AnxBI的抗凝血机理至少说明两点：一是Annexin BI本身不具酶活性；所以不会引起血液中凝血因子的减少；因而可能不会产生由于凝血因子的减少而引起的出血等不良反应。二是该 AnxBI的结合位点是活化血。J、板的膜磷脂。因而可能对以活化血。J、板为主要成分的主动脉血栓具有高亲和力，所以可用于血栓的导向显像，和以此为载体发展血栓靶向性的溶栓药物。但问题在于：如果把AnxBI作为抗凝血药物来用；需要考虑 AflXBI是寄生虫来源的蛋白；具有一定的免疫原性；如果把AI。XBI作为一种血栓靶向的载体来用，需要考虑AnxBI的分子量较大，为 38kDa。因此需要进行基因的结构改造。根据AnxBI具有四个同源结构域的特点；首先模拟构建了一系列突变体群；然后利用同源建模的方法对4 博士学位论文 中 文 摘 要 各突变体进行结构预测，发现各突变体仍然较好保持了钙结合的活性中 。C。通过能量和结构的优化，选择四个结构最为合理的突变体在大肠杆 菌融合表达系统PGEX－ST中表达，表达产物经纯化后，GST－M3；GST－M4 仍然表达出较强的抗凝血活性。该研究表明：AnxBI的抗凝血活性区域 主要位于C端的前三个结构域，亦即仅仅表达AnxBIC端的前三个结构 域就可以保留 AnxBI的抗凝血活性。这样就使得AnxBI的分子量大大减 小，不仅降低了免疫原性，而且为以此为载体构建具有