研究背景大量的流行病学及基础研究表明阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)之间存在着紧密的联系。T2DM为AD的危险因素,而且80%的AD患者糖耐量受损或同时患有糖尿病。目前AD与T2DM相互影响的具体机制尚不明确,但已知二者有一个共同的病理改变——大脑胰岛素抵抗,此病理变化参与了 AD以及T2DM中的认知功能障碍。临床试验研究表明鼻饲胰岛素等改善大脑胰岛素抵抗的治疗方法可以减轻AD患者及T2DM相关的认知功能障碍。因此,胰岛素抵抗是AD和T2DM相关的认知功能障碍的潜在治疗靶点。胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1,IRS-1)是胰岛素信号传递中的枢纽分子,在胰岛素抵抗中起到关键作用,其异常磷酸化可作为大脑胰岛素抵抗的分子标记。胰岛素与其受体结合后,将磷酸化IRS-1的酪氨酸位点,激活下游信号通路,从而发挥神经保护、调节突触可塑性等作用。而当IRS-1特定的抑制性丝氨酸发生磷酸化时,下游通路传递受阻,则会导致胰岛素抵抗。尸检结果发现AD患者大脑中的IRS-1丝氨酸磷酸化异常增加,总蛋白表达下降,而且其特定脑区的异常磷酸化的水平与认知障碍的程度明显相关。因此,明确IRS-1在大脑中的表达调控机制将会为大脑胰岛素抵抗及其参与的认知障碍提供新的治疗思路。DRYK1A基因定位于第21号染色体的唐氏综合征关键区域(Down syndrome critical region,DSCR),它所编码的双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A,DYRK1A)蛋白是一个丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶。DYRK1A在大脑中表达丰富,可以磷酸化多种蛋白,如淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)、早老蛋白-1(Presenilin-1,PS1)和Tau蛋白等。DYRK1A被认为通过磷酸化多种关键蛋白参与了 AD和唐氏综合征(Down syndrome,DS)的认知障碍。此外,DYRK1A还参与调节胰岛素通路,其抑制剂可刺激胰岛β细胞的增殖。Wnt/β-catenin通路是大脑中另外一条与认知功能调节密切相关的信号通路,Wnt信号激活后β-catenin入核并与T细胞因子或淋巴增强因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor,TCF/LEF)转录因子结合,调节 Wnt 靶基因的转录。通过对靶基因的调节,Wnt/β-catenin通路参与突触形成与维持、海马神经再生以及神经环路形成等活动,其通路活性下降与AD的认知功能障碍相关。Wnt/β-catenin通路与胰岛素通路之间也存在紧密联系,例如敲除β-catenin或突变TCF4都会导致胰岛β细胞增殖减慢,破坏葡萄糖稳态。此外,Wnt/β-catenin通路还参与了外周组织中的胰岛素敏感性调控,但是其对大脑胰岛素通路的影响尚不清楚。本研究重点探讨了神经元中IRS-1的表达是否受DYRK1A以及Wnt/β-catenin通路的调控,调控的分子机制以及调控对神经元胰岛素抵抗的影响。这一课题旨在进一步阐明大脑中IRS-1的表达调控机制,以期为大脑胰岛素抵抗及其相关疾病的治疗提供新的思路和途径。第一部分 DYRK1A对IRS-1的调控及其对神经元胰岛素抵抗的影响研究目的前期的研究结果表明IRS-1与DYRK1A之间存在相互作用,前者可能是后者的一个新底物。本研究旨在探讨DYRK1A磷酸化IRS-1的位点,DYRK1A对IRS-1的表达调控,以及该调控对神经元胰岛素抵抗的影响。研究方法1.DYRK1A对IRS-1蛋白表达的影响HEK293、SH-SY5Y细胞中转染DYRK1A过表达或对照质粒,大鼠原代神经元感染DYRK1A过表达或对照病毒,然后利用蛋白免疫印迹技术(western blotting)检测DYRK1A和IRS-1的蛋白水平;用DYRK1A小分子抑制剂Harmine或溶剂对照DMSO刺激上述三种细胞,western blotting检测DYRK1A和IRS-1的蛋白水平。2.DYRK1A对IRS-1蛋白降解的影响HEK293细胞中过表达DYRK1A或者用Harmine抑制DYRK1A活性,然后用 cycloheximide(CHX)chase assay 检测 IRS-1 的降解速率;HEK293 细胞共转IRS-1和DYRK1A过表达质粒,免疫沉淀技术将IRS-1蛋白沉淀下来,检测其泛素化水平。3.DYRK1A与IRS-1的蛋白-蛋白相互作用免疫共沉淀技术研究HEK293细胞中的DYRK1A与IRS-1的相互作用,激光共聚焦显微镜观察DYRK1A与IRS-1的胞内定位,邻位连接技术(proximity ligation assay,PLA)检测神经元中的DYRK1A与IRS-1的共定位。4.检测DYRK1A磷酸化IRS-1的位点HEK293细胞共转IRS-1和DYRK1A过表达质粒或其对照质粒,免疫沉淀技术沉淀IRS-1蛋白后,western blotting检测其总蛋白丝氨酸磷酸化水平。HEK293细胞共转IRS-1和DYRK1A过表达质粒或其对照质粒,western blotting 检测 IRS-1 Ser312、Ser616 磷酸化水平。5.DYRK1A与IRS-1在小鼠大脑中的表达Western blotting检测db/db小鼠及对照m/m小鼠大脑海马及前额叶皮层(prefrontal cortex,PFC)中DYRK1A与IRS-1的蛋白表达水平,实时定量PCR检测其mRNA水平。6.建立SH-SY5Y及神经元胰岛素抵抗细胞模型高浓度胰岛素处理细胞24 h以建立胰岛素抵抗细胞模型;10 nM胰岛素刺激细胞15 min,western blotting检测胰岛素刺激引起的pAKT S473、pGSK3β S9等蛋白变化,以反应胰岛素通路激活程度。7.检测DYRK1A对SH-SY5Y中的胰岛素抵抗的影响在SH-SY5Y细胞中转染DYRK1A过表达或对照质粒,然后分别在基础状态以及胰岛素抵抗状态下,用western blotting检测急性胰岛素刺激引起的IRS-1以及pAKT S473、pGSK3β S9的蛋白水平变化;用DMSO或Harmine处理SH-SY5Y细胞,然后分别在基础状态以及胰岛素抵抗状态下,用western blotting检测急性胰岛素刺激引起的IRS-1以及pAKT S473、pGSK3β S9的蛋白水平变化。8.检测DYRK1A对神经元中的胰岛素抵抗的影响神经元感染DYRK1A过表达病毒或对照病毒,然后分别在基础状态以及胰岛素抵抗状态下,用western blotting检测急性胰岛素刺激引起的IRS-1以及pAKT S473、pGSK3β S9的蛋白水平变化;用DMSO或Harmine处理神经元,然后分别在基础状态以及胰岛素抵抗状态下,用western blotting检测急性胰岛素刺激引起的IRS-1以及pAKT S473、pGSK3β S9的蛋白水平变化。研究结果1.DYRK1A可以升高IRS-1的蛋白表达在HEK293细胞、SH-SY5Y细胞以及神经元中高表达DYRK1A,可以上调IRS-1的表达,而用Harmine处理这三种细胞,则会降低细胞中IRS-1的表达。此外,HEK293细胞中,过表达不同剂量的DYRK1A,可以剂量依赖性的升高IRS-1的蛋白水平。2.DYRK1A通过减少IRS-1的泛素化减慢其降解在HEK293细胞中高表达DYRK1A,使得IRS-1的蛋白降解速率减慢;而用Harmine处理HEK293细胞,则会加快IRS-1的蛋白降解速率。高表达DYRK1A,会降低HEK293细胞内的IRS-1的泛素化。3.DYRK1A与IRS-1之间存在直接相互作用DYRK1A蛋白可以将IRS-1沉淀下来,反之亦然;激光共聚焦显微镜观察发现DYRK1A与IRS-1存在胞内共定位;PLA实验表明DYRK1A与IRS-1在神经元中有共定位信号。4.DYRK1A 磷酸化 IRS-1 的 Ser312、Ser616 位点HEK293中过表达DYRK1A,使IRS-1总的丝氨酸磷酸化增加;DYRK1A会增加IRS-1的Ser312、Ser616位点的磷酸化。5.DYRK1A与IRS-1在db/db小鼠大脑内协同表达db/db小鼠大脑内IRS-1与DYRK1A的mRNA水平较m/m小鼠无明显变化,而DYRK1A、IRS-1的蛋白水平在伴有胰岛素通路障碍的PFC中都升高。DYRK1A和IRS-1的蛋白在海马和PFC的表达水平呈明显正相关。6.成功建立胰岛素抵抗细胞模型经过24小时的高浓度胰岛素刺激,IRS-1在细胞内的表达明显降低,且由低浓度胰岛素短时间刺激引起的pAKT S473、pGSK3β S9表达增加都消失,说明发生了胰岛素抵抗。7.DYRK1A可以改善SH-SY5Y中的胰岛素抵抗高表达DYRK1A,会升高基础状态以及胰岛素抵抗状态下的IRS-1表达。对照细胞在胰岛素抵抗的情况下,急性胰岛素刺激引起的pAKT S473、pGSK3βS9表达增加消失,而在高表达DYRK1A的细胞中,这些增加有部分恢复,说明DYRK1A可以改善胰岛素抵抗。用Harmine刺激SH-SY5Y细胞,则会使基础状态下急性胰岛素引起的pAKT S473、pGSK3β S9表达增加的程度下降,即胰岛素反应性下降。8.DYRK1A可以改善神经元中的胰岛素抵抗高表达DYRK1A,会升高基础状态以及胰岛素抵抗状态下的IRS-1表达。而且会在胰岛素抵抗的状态下使急性胰岛素刺激引起的pAKT S473、pGSK3βS9表达增加部分恢复,也就是说DYRK1A可以改善神经元的胰岛素抵抗。用Harmine刺激神经元,则会使基础状态下由急性胰岛素引起的pAKT S473、pGSK3β S9表达增加的程度下降,即神经元胰岛素反应性下降。研究结论1.DYRK1A可以通过减慢IRS-1的降解升高其蛋白表达。2.DYRK1A与IRS-1有直接相互作用并可以磷酸化IRS-1的Ser312、Ser616位点。3.DYRK1A通过上调IRS-1的表达在神经元中起到活化胰岛素信号通路并改善胰岛素抵抗的作用。研究意义IRS-1是胰岛素通路中的枢纽分子,它的异常表达在大脑胰岛素抵抗中起着非常关键的作用,但其表达调控机制尚不清楚。本研究首次发现DYRK1A是IRS-1的一个调控因子,并明确了 DYRK1A可以通过调节IRS-1的表达对神经元的胰岛素抵抗发挥保护作用。该发现进一步阐明了 IRS-1的调控机制,并为大脑胰岛素抵抗及其参与的认知障碍提供了新的治疗思路。第二部分Wnt/β-catenin通路对IRS-1的调控及其对神经元胰岛素抵抗的影响研究目的已知Wnt/β-catenin通路可以调节外周组织的胰岛素敏感性,但其对大脑胰岛素敏感性的作用尚不清楚。本部分工作主要研究Wnt/β-catenin通路对神经元中IRS-1的表达调控,以及该调控对下游胰岛素信号通路以及胰岛素抵抗的影响,从而探讨Wnt/β-catenin通路在大脑胰岛素功能调节中的作用。研究方法1.Wnt/β-catenin通路激活对IRS-1表达的调控在SH-SY5Y细胞和大鼠原代神经元中采用多种方式激活Wnt通路,然后检测IRS-1的mRNA水平和蛋白水平。SH-SY5Y细胞转染显性失活的TCF4(dominant negative TCF4,TCF4DN),检测 IRS-1 蛋白和 mRNA 水平。2.寻找 IRS-1 启动子上的 Wnt 反应元件(Wnt-responsive element,WRE)首先,将不同长度的IRS-1启动子片段克隆到无启动子活性的荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic上,构建一系列IRS-1启动子截短体。利用双荧光素酶报告实验(dual-luciferase assay)检测Wnt通路对这些截短体的转录调控,缩短WRE位点的范围。然后再使用JASPAR数据库预测Wnt通路转录因子TCF4在缩短后的IRS-1启动子片段上可能的结合位点,并针对预测的WRE序列构建相应的突变截短体,验证Wnt通路对突变后的截短体的调控作用。最后,分别采用凝胶阻滞迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和染色质免疫沉淀实验(chromatin immunoprecipitation,ChIP)验证TCF4与预测的WRE序列的结合。3.Wnt配体Wnt3a对神经元胰岛素敏感性的影响Wnt3a或其溶剂对照PBS处理神经元,然后用胰岛素短时间刺激神经元,western blotting检测由急性胰岛素刺激引起的pAKT S473、pGSK3β S9蛋白水平变化。4.Wnt3a对神经元胰岛素抵抗的影响首先,采用高浓度胰岛素长时间刺激的方式构建神经元胰岛素抵抗细胞模型。在这个模型基础上,用Wnt3a或PBS处理神经元,然后再用western blotting检测由急性胰岛素刺激引起的pAKT S473、pGSK3β S9蛋白水平变化。5.Wnt3a对胰岛素刺激引起的神经元葡萄糖摄取的影响Wnt3a或PBS处理神经元,然后分别在基础状态以及胰岛素抵抗状态下,使用低浓度胰岛素短时间刺激神经元,采用葡萄糖摄取试剂盒检测神经元的葡萄糖摄取能力。研究结果1.Wnt/β-catenin通路激活可以上调IRS-1的表达Wnt/β-catenin通路激活后可以升高SH-SY5Y细胞以及大鼠原代神经元中IRS-1的mRNA以及蛋白表达。而过表达TCF4DN会下调IRS-1的mRNA和蛋白表达。2.IRS-1启动子序列中的-529～-516 bp是一个WRE双荧光素酶报告实验显示Wnt激动剂及TCF4DN对IRS-1的转录调控与IRS-1启动子的-529～-516 bp关系密切。EMSA和ChIP实验进一步证实了 TCF4可以与IRS-1的-529～-516 bp结合。3.Wnt3a提高神经元胰岛素敏感性Wnt3a处理神经元后,IRS-1的表达增加,而且由急性胰岛素刺激引起的pAKT S473、pGSK3β S9蛋白水平升高也较对照组神经元有了进一步增加,即Wnt3a使神经元的胰岛素敏感性提升。4.Wnt3a改善神经元胰岛素抵抗高浓度胰岛素长时间刺激成功诱导了神经元的胰岛素抵抗。在这个模型基础上,用Wnt3a或PBS处理神经元,然后用低浓度胰岛素短时间刺激细胞,western blotting结果显示急性胰岛素刺激后对照组细胞中pAKT S473、pGSK3β S9蛋白水平几乎不变,而Wnt3a处理组pAKT S473、pGSK3β S9蛋白水平显著升高,也即Wnt3a改善了神经元中的胰岛素抵抗。5.Wnt3a增强了胰岛素刺激引起的神经元葡萄糖摄取结果显示无论是在基础状态还是胰岛素抵抗状态下,用低浓度胰岛素短时间刺激神经元,Wnt3a处理组神经元都比对照组神经元在同样时间内摄取更多的葡萄糖,即Wnt3a增强了胰岛素诱导的神经元葡萄糖摄取能力。研究结论1.Wnt/β-catenin通路的激活可以上调神经元中的IRS-1表达。2.TCF4通过结合IRS-1启动子的-529～-516 bp发挥转录调节作用。3.Wnt3a可以活化神经元胰岛素通路,并改善胰岛素抵抗。4.Wnt3a可以提高胰岛素诱导的神经元葡萄糖摄取能力。研究意义本研究首次发现Wnt/β-catenin可以上调神经元中IRS-1的表达,且这种上调可以活化神经元中的胰岛素信号通路并改善胰岛素抵抗。我们的发现进一步加深了对神经元中IRS-1表达调控机制的理解,也进一步补充了 Wnt/β-catenin在中枢神经系统中的重要作用,为将其作为AD等神经退行性疾病的潜在治疗靶点提供了新的理论依据。