中药饮片在生长环境、采收加工、运输存储等过程中都容易携带或引入大量微生物,影响中药材的质量稳定性。中药饮片中的微生物种类的检测,目前是按照2015版《中国药典》四部通则中“1105非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法”、“1106非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法”及“1107非无菌药品微生物限度标准”中要求执行。传统培养法存在检测时间长、准确率差、效率低、工作量大等缺点,并且由于微生物本身的特性,大部分微生物无法在实验室条件下培养。同时,药典中微生物限度标准只规定研粉口服用贵细饮片、直接口服及泡服饮片不得检出沙门菌/10 g,耐胆盐革兰阴性菌应小于104cfu/1 g,而没有明确规定其他中药饮片及其限度标准。因此,研究中药饮片中微生物种类的快速检测技术,将其应用于特定中药饮片样本的检测,获得其微生物群体信息,不仅对中药饮片的微生物污染风险评估具有重要意义,还可为中药饮片中微生物的质量控制标准的制定提供参考数据。本文将高通量基因检测技术应用于中药饮片中微生物种类的检测,不依赖微生物的分离培养而直接对微生物DNA进行基因检测,大大缩短了检测时间,同时可获得微生物的群体构成和多样性。首先,采用高通量基因微阵列方法,调查了白芍、白术、麦冬等11种常用中药饮片中微生物的携带状况,统计其微生物种类组成。结果表明,11种饮片中检测到涵盖细菌、真菌及病毒三大类共171种微生物,其中细菌最多,占75.44%。细菌的种属主要是肠杆菌属、假单胞菌属及芽孢杆菌属等。其次,根据高通量基因微阵列方法的检测结果,基于实验室现有Ion S5测序平台建立了细菌16S rDNA扩增子文库构建方法,并将其应用于中药饮片中细菌多样性的检测。通过有效Tags数量与原始数据的比值(Effective%)评价反应参数及不同试剂对测序结果的影响分析显示,扩增酶对测序结果影响较大,而DNA模板起始量、PCR循环数、纯化磁珠等对测序结果的影响较小。通过Mock DNA进行物种多样性分析显示,16个细菌群体(涵盖13个细菌属)中可检测绝大多数种属,说明方法适用性良好,可用于样本中的细菌检测及多样性分析。应用Ion S5测序平台细菌16S rDNA扩增子高通量测序方法检测中药饮片中细菌多样性结果表明,11种中药饮片中的细菌种属约有200种,其中肠杆菌属相对丰度最高,假单胞菌属和不动杆菌属次之。最后,分析比较两种基因检测技术对中药饮片细菌多样性的检测结果。在细菌主要种属上,两种方法检测结果基本一致,细菌16S rDNA扩增子高通量测序方法获得的细菌多样性更丰富,而高通量基因微阵列方法由于其更高的灵敏性,对于未知微生物可能导致假阳性结果。两种方法均可用于中药饮片中微生物种类的快速检测,高通量基因微阵列方法适用于中药饮片中已知的细菌、真菌及病毒种类的检测,而细菌16S rDNA扩增子高通量测序方法适用于非预设的细菌多样性检测。