正义RNA病毒复制通常会利用宿主的内膜系统来建立一个相对封闭的微环境以完成自身的复制,这个相对封闭的微环境称为病毒的复制场所(viralreplicationfactories)。早期的研究发现叶绿体是大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus, BSMV)的一个主要复制位点,在BSMV侵染时,叶绿体的形态结构及功能受到严重的影响。而叶绿体作为植物细胞中一个重要的细胞器,在各种生物及非生物胁迫下的三维结构变化还未有报道,因此本研究对BSMV侵染本生烟后的叶绿体形态结构变化尤其是三维结构进行了分析,并对这种变化对其功能的影响进行了初步探究。首先利用透射电子显微镜(TEM)观察了 BSMV侵染本生烟及自然寄主大麦后的细胞病理学变化,BSMV侵染后叶绿体上能够形成大的胞质内含体(Cytoplasmic invagination, CI)结构,在叶绿体膜周边形成很多凹陷结构,形变的叶绿体中还能观察到基质片层重排及退化的现象,同时,BSMV的侵染也能抑制叶绿体基质小管(stromule)的形成。为了明确这些病理结构是否是由病毒引起以及与病毒侵染之间的关系,通过免疫电镜观察到,病毒的复制中间体双链RNA(dsRNA)及复制酶蛋白αa均能够特异地定位于叶绿体膜周边及CI周边的凹陷结构内,揭示了这些凹陷结构就是BSMV的复制场所。为了进一步得到BSMV复制场所的结构信息,利用电子断层成像技术(Electron tomography)对BSMV引起的叶绿体膜形变进行了三维重构及渲染。三维重构的结果显示,BSMV侵染后叶绿体膜周边的凹陷结构是由叶绿体内膜向内凹陷形成,在叶绿体内膜凹陷形成的大的口袋状结构内包裹着不同数量的由叶绿体外膜凹陷形成的小泡结构(spherules),这些小泡结构的直径为50 nm左右,并均具有一个小的开口与外部胞质相连通。通过对不同结构的大小统计分析,这些由外膜凹陷形成的小泡结构更符合之前文献报道的病毒复制场所的典型特征,因此三维重构的结果明确了这些直径为50 nm的小泡才是BSMV真正的复制场所,首次揭示了病毒在叶绿体上建立的复制场所的精细三维结构。此外,利用聚焦离子束扫描电镜(Focused ion beam scanning electron microscopy, FIB/SEM)及三维重构技术对BSMV侵染本生烟后的叶绿体整体结构进行了三维解析,揭示了 CI结构在BSMV侵染的细胞中形态的多样性,并明确了 CI其实是位于叶绿体表面类似于“洞穴” 一样的结构,FIIB/SEM的分析结果首次展示了在病毒胁迫下叶绿体的整体形态结构变化。通过对瞬时表达BSMV不同蛋白及注射接种不同RNA组分的细胞进行电镜观察,证实复制酶蛋白αa是BSMV诱导叶绿体膜形变的关键病毒组分。通过酶保护实验及与叶绿体内外膜marker蛋白的双分子荧光互补(BiFC)实验,证明了 αa蛋白定位于叶绿体外膜表面,αa蛋白叶绿体定位的关键区域为其N端的甲基化转移酶结构域。共聚焦荧光显微镜(CLSM)及TEM分析结果显示,αa定位于叶绿体是其诱导叶绿体膜形变所必需的。同时,还对BSMV侵染后的本生烟叶片进行了转录组和叶绿体蛋白组分析,结果表明BSMV侵染后影响叶绿体多个通路及代谢过程,包括碳固定、光合作用系统、叶绿素生成、叶绿体核糖体生成和脂质代谢等,说明BSMV诱导叶绿体形态的变化与叶绿体相关基因或蛋白表达量的变化相关联,这些差异表达的基因或蛋白可能参与BSMV复制工厂的建成以及后续的症状发生。综上所述,这些研究结果明确了 BSMV复制场所的精细结构,揭示了 BSMV在叶绿体上复制对叶绿体形态结构及相关基因表达的影响,为深入研究病毒侵染过程中病毒与叶绿体的相互作用提供了新的重要信息。