骨质疏松症(osteoporosis,OP)是年龄相关性的常见疾病,以骨量下降、骨的微细结构破坏为特征,主要表现为骨脆性增加,骨折风险增大,即使遭受轻微的外力也容易发生骨折。最近十几年,学者们基于大量有关孕期不良环境、胎儿出生体重和成年慢性疾病之间的相关性研究结果,提出了人类疾病起源的概念—“健康与疾病的发育起源”(Developmental Origins of Health and Disease,DOHaD)。流行病学研究结果表明,宫内生长迟缓(intrauterine growth retardation,IUGR)个体成年后峰值骨量降低,成年后罹患骨质疏松症的风险显著增加,由此推测,骨质疏松症具有宫内起源,可能源于宫内及出生后早期的骨发育不良。既往研究表明,成骨定向分化参与了骨发育过程中骨化中心的形成及骨量的维持。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)作为机体重要的内分泌调节系统,参与了骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨定向分化,在骨发育过程中起着重要作用。骨质疏松症存在骨局部RAS活性和AT1R表达增加,同时伴有BMSCs成骨分化功能抑制等现象。但是宫内时期RAS激活与成骨分化、骨化中心生成之间的关系,至今尚未见研究报道。饮酒是日常常见生活行为,部分怀孕妇女在妊娠期间仍饮酒。研究表明,孕期乙醇暴露(Prenatal ethanol exposure,PEE)可引起胎儿发育异常及子代一系列发育相关疾病,如成年后神经精神性疾病和代谢综合征。这类疾病临床表现广泛,统称为胎儿酒精综合征(FAS),IUGR是其主要特征。本实验室及其他课题组的研究均表明母源性糖皮质激素(glucocorticoid,GC)过暴露是孕期多种不良环境所致IUGR发生的共性现象。有研究提示,GC诱导的OP患者骨局部RAS被激活,成骨分化能力降低。然而,PEE是否会导致子代宫内长骨发育迟缓?这一效应能否持续至出生后?其发生机制是否与母源性高GC所致的RAS慢性激活有关?这些问题均未见报道。为此,本课题拟进行如下工作:1、利用本实验室稳定建立的PEE致子代IUGR模型,证实PEE子代宫内及出生后早期长骨发育不良的现象。2、进一步观察PEE所致子代大鼠长骨局部RAS在不同时间点的变化,探讨PEE致子代大鼠长骨发育不良的宫内编程机制。3、在原、代BMSCs成骨分化模型上,探讨RAS慢性激活介导的高皮质酮对BMSCS成骨分化抑制作用。4、在BMSCs成骨分化模型上,探讨乙醇对BMSCs成骨分化的直接影响。本课题的实施有助于我们更全面的认识PEE子代OP易感现象及其宫内编程机制,更好的理解胎源性OP,也对进一步探索OP的早期预防和治疗方法起到了指导作用。第一部分孕期乙醇暴露致子代长骨发育不良目的:最近十几年,学者们基于大量有关孕期不良环境、胎儿出生体重和成年慢性疾病之间的相关性研究结果,提出了人类疾病起源的概念—“健康与疾病的发育起源”(DOHaD)理论。人群流行病学调查结果表明,出生体重与成年后峰值骨量成正相关,低出生体重人群成年后患骨质疏松症的几率明显增加。本实验室在稳定建立的大鼠IUGR模型中发现,孕期乙醇暴露子代体重、体长较对照组明显降低。为此,我们利用前期稳定建立的IUGR模型,证实孕期乙醇暴露雌性大鼠出生后早期存在长骨发育不良的现象。方法:Wistar母鼠自然受孕后,随机分为对照组和PEE组。从妊娠第9天(gestational day 9,GD9)开始,PEE组给予乙醇(4g/kg·d)暴露灌胃,对照组给予等体积生理盐水,直至孕鼠自然生产。分别于新生(GD20)、出生后(postweek,PW)2周(PW2)及出生后6周(PW6)子代大鼠,测量其体重、体长,分离其股骨,测量股骨长度。HE染色观察骨化中心及生长板长度,Micro CT定量分析股骨干骺端松质骨骨量,骨生物力学测试仪检测股骨脆性。结果:1、与对照组相比,PEE组子代大鼠出生体长缩短,出生体重降低,PW2、PW6体重显著降低,股骨长度显著缩短。2、HE及von Kossa染色发现:与对照组相比,PEE组子代大鼠GD20时股骨全长及骨化中心长度显著缩短,PW2及PW6时生长板的长度变短。3、Micro CT定量分析显示PEE组子代大鼠PW2及PW6干骺端松质骨骨小梁稀疏、变薄,骨小梁连接度降低,骨密度降低,孔隙度增加。4、骨生物力学测试显示,PW2及PW6时,PEE组子代大鼠股骨载荷和绕度均较对照组显著降低。结论:利用本实验室稳定建立的宫内发育迟缓(IUGR)模型,本研究首次提出并证实PEE所致的子代在出生时及出生后早期(PW2及PW6)存在长骨发育不良的现象,主要表现为:股骨长度缩短,初级骨化中心及生长板变短,松质骨骨量减少,骨弹性降低,脆性增加。第二部分母源性糖皮质激素过暴露激活RAS介导PEE所致子代大鼠长骨发育不良目的:大量研究提示,糖皮质激素相关性骨质疏松症患者存在骨局部肾素血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)激活,血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)及其受体(angiotensin receptors,AT1R)表达增加,同时伴有成骨分化功能抑制等现象。本实验室前期研究提示,PEE所致IUGR子代胎鼠暴露于母源性高GC的不良宫内环境中。本研究拟在PEE致子代IUGR模型上,从母源性GC过暴露致成骨RAS慢性激活抑制骨化中心形成及骨发育的角度,提出并确证孕期乙醇暴露所致的雌性子代出生后早期长骨发育不良的宫内RAS编程机制。方法:Wistar母鼠自然受孕后,随机分为对照组和PEE组。从GD9开始,PEE组给予乙醇(4g/kg·d)暴露灌胃,对照组给予等体积生理盐水,直至孕鼠自然生产。分别在不同时间点(GD20、PW2、PW6)取子代大鼠股骨松质骨区,用Trizol法提取骨组织RNA,分别检测成骨相关基因及GC活化系统的相关基因的mRNA表达。用直接测序法检测子代大鼠松质骨区ACE基因启动子区DNA甲基化改变。结果:1.在宫内及出生后早期,PEE组子代大鼠骨组织成骨分化相关基因表达抑制。2.在宫内及出生后早期,PEE组子代大鼠骨组织局部RAS激活,具体表现为:ACEmRNA表达增高,AT1R、AT2R表达抑制,AT1R/AT2R比值升高。3.PEE组子代大鼠骨组织GC活化系统被激活,主要表现为:GR及C/EBPamRNA表达水平升高。4、PEE组子代大鼠骨局部ACE基因启动子区处于DNA低甲基化水平。结论:本研究利用孕期乙醇暴露大鼠IUGR模型上,首次发现孕期乙醇暴露雌性子代大鼠在宫内及出生后早期长骨发育迟缓可能与骨局部母源性高GC所致的RAS持续慢性激活(ACE持续高表达,ATRs表达抑制)有关。第三部分高糖皮质激素通过GR/C/EBPα/Dnmts激活RAS抑制BMSCs成骨分化目的:前两部分动物在体实验证实孕期乙醇暴露所致IUGR子代大鼠出生后早期骨发育不良,可能与宫内时期母源性GC过暴露激活RAS导致成骨分化抑制,引起长骨发育不良,这一宫内发育不良现象可以编程至出生后。然而,这一潜在的机制并无直接证据。本实验利用前期稳定建立的BMSCs成骨分化模型,在细胞水平利用GR抑制剂及ACE抑制剂从正反两方面确证高GC-RAS激活-BMSCS成骨分化抑制之间的关系。方法:在本实验室稳定建立的BMSCs成骨分化模型上,我们用不同浓度皮质酮(0、50、250、1250ng/ml)处理细胞,观察其矿化结节染色,用Trizol提取细胞RNA,检测成骨相关基因及RAS组分相关基因的表达。在BMSCs成骨分化模型上,利用GR抑制剂(米非司酮10mM)及ACE抑制剂(依那普利10mM)处理细胞,再加入高浓度皮质酮(1250mM)处理细胞,检测成骨相关基因表达及RAS组分基因表达。同时用直接测序法检测ACE启动子区DNA甲基化改变。结果:1.高浓度皮质酮处理BMSCs,成骨标志基因BSP、BGLAP、Runx2及ALP的mRNA表达显著降低。2.高浓度皮质酮处理BMSCs,GR/C/EBPα增高,RAS被激活(ACEmmRNA表达增高,AT1R、AT2R表达抑制),ACE DNA总甲基化率降低,DNA甲基转移酶Dnmtl表达显著增高。3.应用GR抑制剂处理BMSCs阻断高GC的作用后,被高GC抑制的BMSCs成骨能力部分逆转,ACE低甲基化及高表达也部分被逆转。4.应用ACEI拮抗部分ACE的作用后,被高GC抑制的BMSCs成骨能力部分逆转。结论:本实验利用BMSCs成骨分化模型,首次证明高浓度皮质酮通过GC活化系统(GR/C/EBPα表达增加),降低ACE总甲基化率并促进其表达,激活BMSCs RAS,抑制其成骨分化。第四部分乙醇对BMSCs成骨分化的影响及可能机制目的:利用BMSCs成骨分化模型,证实乙醇对BMSCs成骨分化可能存在直接作用,并探讨其可能的分子机制。方法:提取Wistar大鼠原代BMSCs,传代至第3代后,建立BMSCS成骨分化模型诱导其向成骨细胞分化,在定向诱导分化过程中,给予乙醇(0、0.8、4、20、100mM)处理,用MTT法检测细胞增殖,在分化5天后用TRizol收获细胞,检测相关标志基因表达的变化。结果:1、不同浓度乙醇对BMSCs增殖无显著性毒性作用。2、高浓度乙醇(100mM)处理BMSCs,GR/C/EBPα表达增加,成骨分化基因表达抑制。3、高浓度乙醇(1OOmM)处理BMSCs,Egr-1表达增加,11β-HSD2表达抑制。结论:乙醇可能通过激活cAMP/PKA/Egr-1通路而抑制11β-HSD2的表达,减弱细胞局部对GC的屏障作用,而加剧GC对细胞的作用,本部分研究为阐明乙醇可能在孕期乙醇暴露所致长骨发育不良中有直接作用,提供一定的理论依据。