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研究目的:基于网络药理学方法探讨祛痒化湿方治疗肛周湿疹、瘙痒潜在的作用靶点和信号通路,并通过进一步的体外实验验证,为该方法的科学性有效性提供一定证据,为中药的新药研发打下基础。研究方法:采用中药系统药理学分析平台(TCMSP)和中药分子机制生物信息学分析工具(BATMAN-TCM)预测祛痒化湿方中已知作用的化学成分,通过UniProt、GeneCards等数据库查询对应的基因靶点,分别用可视化的网络药理学工具Cytoscape软件构建祛痒化湿方-活性化合物-疾病的靶点网络图以及STRING软件构建祛痒化湿方治病靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI),并用DAVID平台对化合物靶点网络进行基因功能注释分析(GO)和信号通路富集分析(KEGG),揭示祛痒化湿方治疗肛周湿疹、瘙痒潜在的作用靶点和信号通路。验证祛痒化湿方对人角质形成细胞(HaCaT)抗炎作用机制。CCK8活性测定用于评估祛痒化湿方在HaCaT细胞中的半数抑制浓度(IC50)。用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)刺激细胞,诱导炎症反应,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定IL-6、IL-1β、TN F-α炎症因子在诱导下的HaCaT细胞中的表达,Western blot测定信号转导与转录激活因子3(STAT3)和Janus激酶2(JAK2)的磷酸化水平。研究结果:发现祛痒化湿方治病潜在的靶点83个,如PIK3CA、STAT3、EGFR、IL-6、IL-10、JAK2、JAK1、TNF等。同时靶蛋白基因功能注释分析得到生物过程、分子功能、细胞组成的相关条目。KEGG信号通路富集分析显示,大多数基因富集到了 PI3K-Akt signaling pathway、NF signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、FoxO signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、MAPK signaling pathway 等。细胞试验中,祛痒化湿方呈浓度依赖性地抑制HaCaT细胞增殖活性,IC50为672.6μg/ml。在TNF-α和IFN-γ刺激的细胞中,可观察到高中低浓度的祛痒化湿方可抑制IL-6、IL-1β、TNF-α炎症因子的产生和表达,以及STAT3、JAK2的表达和磷酸化。研究结论:祛痒化湿方对肛周湿疹、瘙痒的治疗作用可能是多成分、多靶标、多途径的。推测主要通过多条免疫学通路、受体信号通路、细胞因子/趋化因子通路等,参与免疫、炎症、凋亡、基因转录、基因表达等生物过程。进一步通过体外实验结果验证,祛痒化湿方可以通过抑制JAK2和STAT3的磷酸化,阻断JAK2/STAT3信号通路来发挥抗炎作用。