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地塞米松是一种强效的人工合成糖皮质激素,由于其具有强大的抗炎、抗休克和免疫抑制的功能而被广泛使用。然而长期或者过量使用地塞米松也会伴随肌肉萎缩等副作用,目前肌肉萎缩的治疗仍是一个亟待解决的问题,急需新的有效的治疗方法。而MicroRNA(miRNA)作为近些年的热点研究内容,很可能给地塞米松诱导的肌肉萎缩提供新的治疗手段。miRNA是内源性的、小片段的、非编码RNA,通过与靶基因的mRNA的3?非翻译区(3?UTR)结合抑制靶基因表达。在已有的文献报道中,miRNA在地塞米松处理的C2C12肌管的表达量差异已被研究人员使用miRNA微阵列检测过。该实验结果显示,在地塞米松处理的C2C12肌管中,miR-322等miRNA的表达量明显增加。本研究利用地塞米松处理C2C12成肌细胞分化成的C2C12肌管。免疫荧光实验显示地塞米松使C2C12肌管直径缩小(p<0.01)。实时荧光定量PCR实验结果显示肌萎缩的标记基因Atrogin-1和MuRF-1的表达量升高(p<0.05)。这些结果表明地塞米松诱导C2C12肌管发生萎缩。在地塞米松诱导的C2C12肌管中检测miR-322的表达水平,结果显示地塞米松增加了miR-322的表达量(p<0.05),这与以前的miRNA微阵列检测结果相似。为了研究miR-322的作用,人工合成的miR-322模拟物和miR-322抑制剂被使用去升高或降低C2C12肌管中miR-322的表达量(p<0.05)。免疫荧光和荧光定量PCR实验结果显示,过表达miR-322减小了地塞米松诱导的C2C12肌管的直径(p<0.05),同时伴随着Atrogin-1和MuRF-1的表达量增加(p<0.001)。然而,miR-322抑制剂在地塞米松处理的C2C12肌管中表现出相反的作用(p<0.05)。因此,miR-322加重了地塞米松诱导的C2C12肌管萎缩。为了研究miR-322促进地塞米松诱导肌肉萎缩的机制,我们使用生物信息学工具TargetScan预测IGF1R和INSR为miR-322可能的靶基因。然后包含miR-322结合位点的IGF1R和INSR的3?-UTR被克隆到荧光素酶质粒中。荧光素酶检测结果表明,miR-322模拟物降低了质粒的荧光素酶活性(p<0.05),miR-322抑制剂升高了质粒的荧光素酶活性(p<0.05)。在C2C12肌管中转染miR-322模拟物,免疫印迹实验结果显示IGF1R和INSR蛋白质表达水平降低(p<0.01)。相反,转染miR-322抑制剂导致IGF1R和INSR表达量升高(p<0.01)。实验进一步评估了IGF1R和INSR的功能是否可以介导地塞米松诱导的C2C12肌管的萎缩。结果表明,抑制IGF1R或INSR表达量均可加重地塞米松诱导的C2C12肌管的萎缩(p<0.05)。这些结果表明,IGF1R和INSR在miR-322加重地塞米松诱导C2C12肌管萎缩的过程中起重要作用。miR-322在地塞米松诱导肌肉萎缩的过程中的作用也需要在动物体内实验验证。实验结果显示,腓肠肌重量与体重的比例(GW/BW)和小鼠抓力由于miR-322模拟物的作用而减小(p<0.05),由于miR-322抑制剂的作用而提高(p<0.05)。苏木精-伊红染色(HE染色)显示miR-322模拟物使肌纤维直径下降(p<0.05),而miR-322抑制剂对小鼠腓肠肌的作用与miR-322模拟物相反(p<0.01)。同时,miR-322模拟物也升高了Atrogin-1和MuRF-1的表达量,而miR-322抑制剂却降低了Atrogin-1和MuRF-1的表达量(p<0.01)。综上所述,miR-322参与了地塞米松诱导的肌肉萎缩,抑制miR-322的表达量能减弱地塞米松诱导的肌肉萎缩。这为肌肉萎缩的治疗以及地塞米松的安全应用提供了理论基础。