背景:癌症是全世界发病率和死亡率都很高的一种疾病,已经严重威胁到人类的生命安全与健康。降低人类癌症死亡率的最有效方法是早期诊断与治疗,基于“液体活检”的早期分子诊断技术,近年来逐渐成为一个研究热点。液体活检不别于传统的手术组织活检和穿刺活检,它主要从血液、尿液、唾液、乳汁等不同生物体液中检测由原发肿瘤细胞脱落至外周血液循环的肿瘤生物标志物,包括循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells,CTCs）、游离DNA、RNA和外泌体等,从而获取与肿瘤相关的基因信息。近年来,细胞外囊泡,尤其是外泌体（Exosomes）,由于其在肿瘤细胞间发挥的运输和通讯等重要作用受到越来越多研究者的关注。作为肿瘤液体活检中最具前景的一类检测对象,外泌体是一种具有磷脂双分子层结构的囊泡状小体（30-200nm）。外泌体由不同种类的细胞分泌,然后释放至生物体液中,其含量丰富、特异性高、大小均匀,包含多种与肿瘤相关联的基因遗传信息。外泌体的内容物包含大量特异性生物标记物,如RNA、DNA、脂质和蛋白质等多种生物分子,能够直接或间接调控受体细胞的功能和表型,在调节肿瘤的发生、发展过程中具有十分重要的作用。目前已有一系列临床研究把外泌体作为肿瘤生物标记物,精确定量并分析其内容物的类型和含量特性,用于癌症的早期诊断。高纯度提取、精确定量检测外泌体则是开展这些研究的首要关键环节。然而,迄今为止,我们仍缺乏标准化的技术手段来分离与定量检测外泌体,如何高效地提取检测高纯度的外泌体,是目前肿瘤外泌体液体活检所面临的一个巨大挑战。目的:针对外泌体的高纯度提取分离及精确定量分析两大技术难题,本研究分别建立了凝胶电泳微流控芯片和免疫分析型生物传感器。一种性能优越且便携小巧的凝胶电泳微流芯片用于人体血浆中外泌体的提取分离,高效、快速地提取人体原始血浆样品中的外泌体,使外泌体产量较高且所需成本较低,拟解决外泌体提取费时费力、成本较高等问题,也为基于外泌体的实时诊断提供一种技术可能性。一种高灵敏度、特异性强的免疫分析型生物传感器用于定量检测各种生物样品中的外泌体,特别是肿瘤来源的外泌体。该免疫分析型生物传感器有望用于癌症早期诊断中肿瘤相关外泌体等生物标记物的超灵敏检测,为肿瘤的早期诊断和研究提供一种新的思路。方法:1.收集健康人体外周血液样本,自主设计并制备基于纳米多孔薄膜和琼脂糖凝胶电泳的微流芯片用于提取人体血液样本中的外泌体。提取的外泌体使用透射电镜技术观察其形态学特征、Nanosight技术分析其浓度和粒径分布、Western blotting技术鉴定其表面标志性蛋白。将凝胶电泳微流控芯片和超速离心法所提取的外泌体分别进行粒径和浓度方面的比较,研究两种方法分别提取分离外泌体的效率。最后,通过RT-PCR技术研究凝胶电泳微流控芯片提取的外泌体中的mi RNA-21相对表达量,探讨其后续下游分析的可行性。2.基于磁纳米颗粒（Magnetic nanoparticles,MNPs）捕获和辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）的催化作用,设计了一种免疫分析型的荧光生物传感器用于肿瘤相关外泌体的检测。以MNPs为底物,通过在MNPs的表面修饰CD63抗体来捕获外泌体。然后用生物素修饰的Ep CAM抗体捕获特异性表达Ep CAM的肿瘤相关外泌体,从而形成“抗体-外泌体-抗体”样的三明治夹层结构。通过添加SA-HRP,SA可以与生物素结合进而将HRP连接至“抗体-外泌体-抗体”样的三明治夹层结构中。最后,加入酪胺（作为底物）和H2O2（作为催化剂）,在H2O2存在的条件下,SA-HRP能够催化酪胺形成二聚体从而产生荧光信号。通过检测最终的荧光强度来具体量化肿瘤相关外泌体的含量。结果:1.凝胶电泳微流芯片可在1 h内快速地从血浆中高效率地提取出纯度高、大小完整、尺寸分布在30–200 nm之间的外泌体,能够满足后续下游分析的需求。2.通过与超速离心法进行对比分析,当血浆样本量小于100μL时,凝胶电泳微流芯片提取外泌体的效率为超速离心法的3.80倍。凝胶电泳微流芯片提取外泌体的优化参数是:电场电压:100 V;琼脂糖凝胶浓度:1.0%;注射泵流速:0.1 m L/h。3.免疫分析型生物传感器可用于肿瘤相关外泌体的检测。该传感器的荧光强度与外泌体的浓度呈现出良好的线性关系,检测限低至200（±9）/m L,线性范围为576（±15）/m L至5.76×107（±5.1×105）/m L。4.荧光测量时,激发波长设置为320 nm,发射波长的范围设置为370 nm-550nm。免疫分析型生物传感器在24 h内的稳定性良好,该传感器还可用于HCC患者血浆中外泌体的检测。结论:1.凝胶电泳微流控芯片可快速高效地提取分离出人血浆中的外泌体。2.免疫分析型生物传感器能够高灵敏高特异性地检测肿瘤相关的外泌体。