背景：　　子痫前期（Preeclampsia，PE）是以妊娠20周后新发高血压、蛋白尿和多器官功能受累为特征的一组症候群。发生率为2-8%，且近年来有增高趋势。PE病因和发病机制至今尚未完全阐明。胎盘娩出是子痫前期唯一有效的治疗方法。子痫前期被认为是“胎盘源性”疾病，由滋养细胞侵入不足开始，而以母体广泛内皮功能失调为终点。人类胎盘具有丰富的血管形成物质，这些促血管生成因子和抗血管生成因子不仅在调节胎盘血管构建中具有重要作用，而且释放入循环后对母体血管内皮功能产生重要影响。胎盘释放的抗血管生成因素（sFlt-1、sEng）和促血管生成因素（VEGF、PIGF和TGF-β）对于维持血管内皮细胞正常生长及功能发挥重要作用。促血管生成和抗血管生成调节机制失衡是PE发病的关键因素。正常情况下，sFlt-l与VEGF保持动态平衡，共同形成血管生成反馈机制。但是在子痫前期时这种平衡被打破。因此研究胎盘血管形成对探讨子痫前期的发病机制无疑具有重要的意义。　　Chemerin是一种与子痫前期密切相关的脂肪因子。已有研究表明,子痫前期患者血清中Chemerin水平明显升高，并与子痫前期的严重程度独立相关。近期有研究显示，Chemerin具有强效促血管生成功能，chemerin具有剂量依赖性诱导内皮细胞基质金属蛋白酶（MMP-2和MMP-9）分解的活性。但是至今尚没有关于Chemerin在胎盘血管生成中的作用的报道。　　本研究从子痫前期胎盘微血管生成调控机制的角度出发,利用细胞和分子生物学技术，研究Chemerin在胎盘血管生成中的作用，研究Chemerin在激活MAPK/Akt级联信号通路诱导HPMECs血管生成中的作用，从而探讨子痫前期内皮功能受损的新机制，为将来Chemerin用于子痫前期的病因治疗提供理论依据。　　第一部分 人胎盘微血管内皮细胞的原代培养　　目的：　　从子痫前期患者胎盘中分离人胎盘微血管内皮细胞，通过纯化、培养、传代建立稳定的胎盘微血管内皮细胞细胞株。　　方法：　　1.收集、准备绒毛：收集2014年1月至2月广州医科大学附属广东省妇女儿童医院诊断并住院治疗的子痫前期患者剖宫产后的胎盘组织，在无菌条件下去除胎膜，并用预冷的生理盐水清洗胎盘组织的血迹。　　2.分离纯化和培养传代胎盘微血管内皮细胞：经过酶消化法和非连续Percoll密度梯度离心获得人胎盘微血管内皮细胞并培养传代。　　3.MTT法检测第4代人胎盘微血管内皮细胞生长曲线。　　4.鉴定胎盘微血管内皮细胞：采用FVIII相关抗原抗体和CD31抗体的免疫细胞荧光法对获得的细胞进行鉴定。　　结果：　　1.原代培养细胞细胞形态不一，差异很大，大多细胞呈纺锤形、不规则形或三角形，24h多数能贴壁生长，但生长缓慢，约9天左右才进入指数增长期。经3次传代后，传代细胞较原代细胞生长活跃，刚开始接种时细胞为明亮的圆球形,且悬浮于培养基中,随后可见部分细胞贴壁,7天左右细胞能铺满培养瓶底,并呈现典型的“铺路石”征。　　2.FVIII和CD31荧光免疫检测结果显示,细胞胞浆发绿色荧光,呈阳性表达，具备微血管内皮细胞特征，证实分离培养的细胞为胎盘微血管内皮细胞。　　3.MTT法检测第4代人胎盘微血管内皮细胞生长曲线显示，细胞生长曲线呈现倒“S”型，呈现“潜伏期-对数生长期-平台期”的生长模式。　　结论：　　成功分离纯化胎盘微血管内皮细胞，并建立稳定的胎盘微血管内皮细胞细胞株。　　第二部分 Chemerin对胎盘微血管内皮细胞生长的影响　　目的：　　通过细胞实验观察Chemerin对胎盘微血管内皮细胞生长的影响,了解Chemerin对胎盘血管生长发育的作用。　　方法：　　1.增殖实验:将HPMECs分为6组，分别为空白对照组、0.1ng/ml、0.3ng/ml、1.0ng/ml、3.0ng/ml和10.0ng/mlChemerin组,设5个复孔，接种于48孔板内,常规培养24h后每孔加入5mg/mLMTT，置于37℃培养箱中继续培养4h后,终止培养,每孔加入DMSO溶液150μl充分振荡10min，使结品充分溶解,酶标仪检测570nm处各孔吸光值。　　2.迁移实验：于Transwell小室上层分别加入含浓度为0.1ng/ml、0.3ng/ml、1.0ng/ml、3.0ng/ml和10.0ng/ml的Chemerin无血清培养液,同时加入0.lml HPMECs细胞悬液，细胞浓度为1xl06个/mL,设5个复孔，置于37℃5%CO2培养箱中培养6h，取出Transwell小室，用棉签擦去上室面的细胞，结晶紫染色，显微镜下随机5个视野计数下室面细胞。　　3.管腔形成实验：将HPMECs细胞用DMEM培养液重悬,接种于包被有Matrigel(300μl)的24孔培养板中,分别加入浓度为0.1ng/ml、0.3ng/ml、1.0ng/ml、3.0ng/ml和10.0ng/ml的Chemerin，置于37℃5%CO2培养箱中培养8h后倒置相差显微镜下观察,以形成的管腔数量表示不同Chemerin浓度下细胞形成管腔的能力。　　结果：　　1．MTT实验结果显示，Chemerin能显著的提高胎盘微血管内皮细胞的增殖能力，当Chemerin浓度在0.3ng/ml的时候胎盘微血管内皮细胞的增殖能力最强。在0.1、0.3、1.0和3.0ng/ml Chemerin各组的吸光值分别为0.505±0.005、0.594±0.006、0.573±0.004、0.446±0.005与对照组的0.396±0.005相比均有显著的差异（P＜0.01）。　　2．迁移实验结果显示，Chemerin能显著的提高胎盘微血管内皮细胞的迁移能力,在浓度为0.1、0.3、1.0、3.0ng/ml的Chemerin的作用下，胎盘微血管内皮细胞迁移至下室面的细胞数分别为25.6±2.60、42.4±3.20、33.4±2.70、24.4±2.88与对照组的19.2±3.19相比均明显增多（P＜0.05）。　　3．管腔形成实验结果显示，Chemerin能显著的提高胎盘微血管内皮细胞的管腔形成能力，当Chemerin浓度在10ng/ml的时候胎盘微血管内皮细胞的管腔形成能力最强，具有剂量依赖效应，在0.1、0.3、1、3和10ng/ml Chemerin的管腔形成数分别是1.20±0.83、2.80±0.83、3.40±1.14、3.80±0.83、5.60±1.14与对照组的0相比较均有显著的增加（P＜0.05）。　　结论：　　Chemerin可促进胎盘微血管内皮细胞的增殖活力、迁移能力和管腔形成能力，提示Chemerin能促胎盘微血管生成。　　第三部分 Chemerin诱导胎盘微血管内皮细胞生成血管的信号通路研究　　目的：　　探讨Chemerin诱导胎盘微血管内皮细胞生成血管的信号通路　　方法：　　1、采用不同浓度的Chemerin（空白对照，0.1ng/ml、0.3ng/ml、1.0ng/ml、3.0ng/ml和10.0ng/ml）孵育胎盘微血管内皮细胞。　　2、Western blot方法检测经过不同浓度的Chemerin处理后的胎盘微血管内皮细胞中ERK1/2、P38MAPK和AKT的磷酸化水平。　　3、Western blot方法检测胎盘微血管内皮细胞中ChemR23的表达。　　结果：　　Western blot结果显示，与对照组相比，Chemerin组显著增加p38MAPK的磷酸化程度，且在Chemerin浓度为0.3ng/ml时，p38MAPK的磷酸化程度最大（P＜0.01）；与对照组相比，Chemerin组显著增加ERK1/2的磷酸化程度，且在Chemerin浓度为1.0ng/ml时ERK1/2的磷酸化程度最大；与对照组相比，Chemerin组显著增加AKT的磷酸化程度，且在Chemerin浓度为1.0ng/ml时中AKT的磷酸化程度最大（P＜0.01）。同时，胎盘微血管内皮细胞中有ChemR23的表达。　　结论：　　胎盘微血管内皮细胞中有ChemR23的表达。Chemerin能显著地增加胎盘微血管内皮细胞中MAPK、AKT信号通路中P38、ERK1/2、AKT的磷酸化水平，并且存在一定的剂量-效应关系；MAPK/AKT信号传导通路参与胎盘微血管的生成。