铜(Cu)是植物生长发育所必需的微量营养元素,在植物光合作用、呼吸作用、氧化胁迫、激素应激和细胞壁代谢等众多生理过程中扮演重要角色。但过量的铜对植物是十分有害的,可以导致大量活性氧自由基的产生,诱导DNA损伤、蛋白质氧化、膜质过氧化等,进而影响植物一系列生化反应和生理过程。葡萄(Vitis vinifera L.)是世界性的重要果树,也是我国最为重要的经济果树之一。随着含铜杀菌剂在葡萄生产中的广泛应用,葡萄铜胁迫逐渐成为影响葡萄生产的重要挑战。本研究通过分析葡萄组培苗在铜胁迫下的生长、生理及铜平衡相关基因的分子反应,初步了解葡萄耐铜的生理和分子机理。在此基础上,利用高通量测序技术在转录组水平和miRNA调控水平全面分析葡萄应答铜胁迫的基因和miRNA,通过转基因功能验证表明葡萄miR398靶基因CSD2能提高植株耐铜性,为在分子水平更全面地揭示葡萄耐铜机理提供了理论基础。最后对葡萄响应铜胁迫的保守miRNA不同家族成员的表达模式进行了分析,了解葡萄miRNA家族成员的多元化表达以及发现起关键作用的成员,有利于我们更好的认识葡萄miRNA的调节作用。主要研究结论如下:1.铜胁迫对葡萄组培苗生理指标及铜平衡相关基因表达的影响采用组培法,研究葡萄在不同浓度铜处理下的反应。结果表明:高铜和低铜胁迫均能抑制根的生长,且高铜抑制更加明显。在高铜胁迫下,葡萄根和叶片中铜离子含量迅速增加,丙二醛(MDA)的含量也随之升高,而超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)酶活性增加来保护植物免受铜胁迫伤害。分析了 19个涉及铜代谢平衡调节相关的铜转运体(CTr),分子伴侣(Chaperones)和P-型ATP酶(P-type ATPases)的编码基因在根和叶中的表达模式。研究结果表明,铜转运体CTr1、CTr2和CTr8在铜过量和缺乏条件下均表达上升,ZIP2在铜过量时表达下调,在铜缺失时表达上升,而ZIP4在相同条件下与ZIP2有相反的表达模式。进一步铜分子伴侣和P型ATP酶编码基因也在不同程度上应答外界铜浓度的变化。2.葡萄铜胁迫的转录组分析本研究采用转录组测序(RNA-seq)从全基因组水平分析了葡萄对铜吸收、转运、耐性与解毒相关的基因表达与调控的分子机制。共产生了 23,257个转录本,其中19,414个转录本没有明显的差异表达,3,843个转录本有明显的差异表达,其中包括1,892个上调基因和1,951个下调基因。在这项研究中,我们发现了很多已知的和新的Cu诱导或抑制基因。生物学分析表明,铜胁迫能抑制葡萄叶绿素的代谢和光合作用。铜胁迫下,抗氧化酶、热激蛋白、病程相关蛋白及次级代谢产物等ROS清除系统均被强烈诱导。在激素信号中,脱落酸在铜胁迫下表现出负调控作用,而乙烯、生长素、茉莉酸和油菜素内酯均表现出正调控作用等。本研究也鉴定了一系列编码铜转运体、P1B型ATP酶、ABC转运蛋白、MATE转录因子的基因。总体而言,本研究首次从全基因组水平分析了葡萄铜胁迫应答基因,并为全面理解葡萄应答铜胁迫的代谢调控机制提供线索。3.葡萄铜胁迫响应microRNAs的识别、鉴定与靶基因CSD2功能验证本研究构建了铜胁迫处理和清水处理(对照)两个miRNA文库。通过小RNA高通量测序共鉴定了158条保守miRNAs和98条新miRNAs,在保守miRNAs中,95条miRNAs在铜胁迫下表达下调,有4条miRNAs在铜胁迫下表达上调;在新鉴定的miRNAs中,35条miRNAs在铜胁迫下表达下调,12条miRNAs在铜胁迫下表达上调。在保守miRNA中,miR398在铜胁迫下表达下调最为显著,结合转录组数据和RLM-RACE分析表明葡萄miR398能介导CSD2裂解,通过转基因功能验证,表明在烟草中过表达葡萄CSD2能提高植株耐铜性。该研究为深入了解葡萄miRNAs响应铜胁迫的分子机理研究提供了理论基础。通过对转录组和小RNA两个调控水平数据的结合分析,为分子水平揭示葡萄耐铜机理和抗性育种提供了理论依据。4.葡萄miRNA不同家族成员的表达模式分析miRNA属于多基因家族,并且家族成员间仅相差一个或数个碱基,会造成其与靶基因匹配程度和调控强度的变化。本研究采用qRT-PCR和miR-RACE研究了8个响应铜胁迫的葡萄miRNA(miR398、miR159、miR164、miR167、miR172、miR319、miR393和miR396)和它们的家族成员在不同组织和不同发育时期的表达模式。结果表明,Vv-miRNAs的表达水平在葡萄发育过程中是动态变化的;同一Vv-miRNA家族不同成员的表达也存在时空特异性。比较同一Vv-miRNA家族不同成员的表达模式表明,许多miRNA家族中可能有一个关键成员在调节靶基因方面起主要的作用。了解葡萄家族成员的多元化表达以及发现起关键作用的成员有利于我们更好的认识Vv-miRNA的调节作用。