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本研究以小×胡杨(Populus simonii×P.euphratica)、741毛白杨(PopulusaIba×(P.davidiana×P.simonii)×P. tomentosa)为试材,进行了再生体系、农杆菌介导的抗逆基因转化研究,以期培育出抗逆境的基因工程杨树新品系。主要结果如下:
1、以小×胡杨为研究对象,在建立组培再生体系过程中出现了外植体褐化现象,对影响小X胡杨组培中褐化的因素进行了研究,并在一定程度上控制了小×胡杨褐化的发生,为下一步组织培养奠定了基础。试验结果表明:6-BA和IBA浓度的变化对褐化现象基本没有影响;外植体经过5℃,12h预处理、使用1/2MS培养基、低温暗处理和常温暗处理都能在一定程度上减轻褐化;抗氧化剂和吸附剂对褐化控制作用较为明显,其中PVP效果较好,VC次之,Na<,2>S<,2>O<,3>最差。
2、通过对741毛白杨的组培再生体系的优化,得到了高频再生体系,同时阐述了激素浓度、叶片来源、黑暗培养、叶片放置方式等对叶片再生体系的影响。741毛白杨无菌苗叶片的最佳不定芽诱导培养基为MS+6-BAl.0mg/L+IBA0.1mg/L;选择无根的无菌试管苗的叶片作为试验材料,进行3d黑暗培养等方法都可提高不定芽诱导效率;不走芽继代培养基为MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.05mg/L;不定芽生根的最佳培养基为1/2MS+IBA0.05mg/L。741毛白杨叶片不定芽诱导的潮霉素临界浓度为3mg/L;不定芽生根潮霉素临界浓度为5mg/L;在筛选过程中选用Cef400mg/L作为抑菌抗生素浓度。
3、对影响农杆菌介导的杨树遗传转化的几个因素进行了探讨。结果表明,MS液体培养基作为工程菌液获得的抗性芽再生频率明显高于YBP液体培养基作为工程菌液获得的抗性芽再生频率;共培养时间不同潮霉素抗性芽诱导率也不同,共培养时间为3d时,诱导率最高,与其他处理差异显著;共培养培养基加入乙酰丁香酮时,pH调到5.2诱导潮霉素抗性芽效果最显著;在本试验中,推迟筛选对转化效率的影响不大。
利用农杆菌对741毛白杨进行抗逆境基因(YCPA2)转化,经PCR检测,在抗性植株DNA中扩增出与目的基因大小相同的片断,初步确认目的基因已经整合到741毛白杨基因组中。