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实验背景与实验目的:肝细胞癌是我国最常见也是死亡率最高的恶性肿瘤之一,每年因患肝癌而死亡的人数约占全世界肝癌死亡人数的50%;其恶性程度高、进展快,且容易发生术后复发和转移是限制其疗效的关键因素。肝癌的发生、发展和转移是一个由多基因控制,受多因素影响,多阶段多步骤的复杂过程;在这个过程中癌基因的激活或抑癌基因的失活是肿瘤发生发展最基本的分子基础。寻找肿瘤恶变过程发生异常改变的基因,研究其表达调控机制,阐明其在肿瘤发生发展中的作用,将有利于我们认识肿瘤发生发展的分子机制,提高肿瘤的临床治疗率。TIP30 ,是一种30kD的Tat(Transactivator of transcription)结合蛋白(Tat-Interactive Protain),又称HTATIP2(HIV-1 Tat interactive protein 2),是Xiao H等在研究人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)的体外转录时发现的,其作为HIV转录的辅助因子可以和Tat相互结合特异性地提高HIV增殖。TIP30在人类的多种组织如心、脑、肺、肾、骨骼肌和胰腺中均有表达,但在多种肿瘤组织中表达下降或缺失。研究表明:一方面,TIP30/CC3是一种转录辅助因子,具有丝/苏氨酸激酶活性可以和RNA聚合酶Ⅱ最大亚基结合并磷酸化其C-末端的七肽重复基序,在特定生理病理环境下调节细胞凋亡和血管生成相关基因的表达从而促进细胞凋亡和抑制肿瘤转移;另一方面TIP30/CC3能够以RanGTP非依赖形式直接与Importinβ家族成员及核孔蛋白相结合抑制核转运蛋白的功能,通过抑制核物质输入促进细胞凋亡来发挥抑癌作用。DNA甲基化是一种基因表观性修饰,它不改变基因序列但会影响染色质结构或修饰DNA空间结构从而影响基因表达。DNA甲基化状态的改变是细胞癌变的关键因素,是肿瘤抑制基因失活的方式之一,它通过基因机制和基因外机制导致细胞增殖和分化的相关基因表达异常,造成细胞失去正常过程的控制而发生恶变形成肿瘤。近年来,DNA甲基化在肿瘤发生发展中的作用日益受到人们的关注,研究肿瘤相关基因的异常甲基化有助于深入理解肿瘤形成机理,并且可以为肿瘤的早期诊断、病理分型、疗效评估及复发检测等提供十分重要的信息。TIP30基因是否存在甲基化改变以及甲基化是否影响了它在肿瘤细胞中的表达,目前国内外尚无相关报道。本课题通过检测肝癌细胞中TIP30基因mRNA的表达,揭示该基因与肝癌的关系,并通过MSP和BSP方法检测基因5’-UTR区的CpG岛甲基化状态,探索该基因在肝癌细胞中下调的原因以及该基因启动子甲基化在肝癌发生发展中的作用。实验方法:1.应用real-time PCR检测TIP30基因mRNA在肝癌细胞中的表达情况,比较肝癌细胞系和正常肝细胞系TIP30基因mRNA的表达差异。2.采用荧光素酶报告基因载体PGL-3 Enhancer分析TIP30启动子在HL7702细胞系中的活性;3.利用PLOTCpG程序对TIP30基因5’-UTR区的CpG岛进行了分析,并利用Methyl Primer Express Software 1.0设计MSP和BSP引物,建立了检测TIP30基因启动子区甲基化状态的方法。4.用MSP和BSP法检测了不同肝癌细胞株TIP30基因5’-UTR区的甲基化状态。5.用甲基化抑制剂处理肝癌细胞,观察其对肝癌细胞TIP30表达的影响。实验结果:1.TIP30基因mRNA在正常肝细胞和肝癌细胞中都有表达,但不同细胞间的表达差异较大2.TIP30基因mRNA在多数肝癌细胞中的表达明显低于正常肝细胞(p<0.01),但在PLC和XJC肝癌细胞中其表达量明显高于正常肝细胞。3.在HL7702细胞中,TIP30基因启动子的-135/-45是TIP30的主要转录活性区,TESS软件分析发现该区域存在SP1多个结合位点。4.PLOTCpG程序分析发现TIP30基因5’-UTR区存在两个典型的CpG岛,一个跨越转录起始位点,一个跨越翻译起始位点。5.MSP和BSP结果显示在TIP30 mRNA表达低的肝癌细胞中部分细胞该基因5’-UTR区是甲基化的,部分TIP30表达低的和TIP30表达高的肝癌细胞及正常肝细胞都没有甲基化现象,说明甲基化参与了TIP30基因的转录调控,是TIP30基因在肝癌中表达降低的原因之一。6.甲基化抑制剂明显提高了5’-UTR区甲基化的肝癌细胞TIP30 mRNA的表达。实验结论:1.首次采用Real-Time PCR方法检测了肝癌细胞和正常肝细胞中TIP30基因mRNA的表达,发现不同细胞TIP30的表达存在较大差异,和正常肝细胞相比多数肝癌细胞TIP30mRNA的表达是降低的,揭示了TIP30和肝癌之间的相关性。2.首次对TIP30基因的启动子功能进行了研究,并发现-135/-45是其主要的转录活性区,该区域存在多个可能的SP1结合位点。3.首次应用PLOTCpG程序对TIP30基因5’-UTR区进行CpG岛分析,发现了两个典型的CpG岛,其中第一个岛CpG二核苷酸含量更丰富,更容易被甲基化。4.首次利用Methyl Primer Express Software 1.0软件设计了TIP30基因5’-UTR区MSP和BSP甲基化检测用引物,建立了TIP30基因甲基化检测方法。5.首次对不同肝癌细胞TIP30基因的甲基化状况进行了检测,明确了甲基化是引起肝癌细胞TIP30基因表达降低的原因之一。