职业性三氯乙烯药疹样皮炎(Occupational medicareentose-like dermatitis induced by trichloroethylene exposure，OMLDTE)，OMLDTE已经成为了研究的热点问题。研究内容主要集中在病例的回顾性职业流行病学调查、病例易感基因多态性、免疫损伤机制等方面。已有的研究表明N-乙酰基转移酶(NAT2)基因Kpn1位点的变异可明显增加OMLDTE的危险性，具有NAT2慢代谢基因型的个体患皮炎危险性明显高于快代谢基因型个体；对醛脱氢酶、醇脱氢酶基因多态性的研究表明人醛脱氢酶2(AL2H2)变异型基因频率在病人中显著低于职业性TCE接触工人，使OMLDTE的危险性显著降低；HLA-B*1301等位基因的多态性与OMLDTE有很强的关系；但遗憾的是这些研究结果尚处于基础研究阶段，尚未在人群中验证，因此还无法作为有效的预防手段应用于实际工作。近年来蛋白质组学的快速发展使得该技术在各个领域的应用都取得丰硕的成果。血清是一种复杂的体液成份，其蛋白组成除了白蛋白、免疫球蛋白(主要是IgG)等高丰度蛋白外，绝大多数是机体组织、细胞分泌和脱落到血中的低丰度蛋白质，其中一些为信号传导和调控的关键蛋白。如果能在血清蛋白中寻找疾病相关的蛋白质标记物，将有利于阐明疾病的发病机理并通过血清学的检测达到早期预防、诊断和治疗疾病的目的。因此开展OMLDTE的血清差异蛋白质组学研究，寻找并鉴定低丰度的功能性蛋白质，将有利于阐明OMLDTE的发病机理，为预防OMLDTE的发生提供科学依据。 目的： 1.了解OMLDTE病例和职业性TCE接触工人TCE的暴露水平，阐明OMLDTE病例的发病特征以及职业性TCE接触工人的暴露应激情况； 2.构建人外周血血清蛋白质双向凝胶电泳平台及优化实验条件； 3.了解OMLDTE病例发病急性期及恢复期血清蛋白质的变化情况； 4.鉴定差异表达蛋白质，了解蛋白的功能，以利于进一步了解OMLDTE涉及的病理过程，为进一步研究OMLDTE免疫机制提供科学的线索。 方法： 1.研究对象： 8例OMLDTE病例用于血清差异蛋白质组学研究，63例职业性TCE接触工人用于与OMLDTE病例进行比较，阐明其发病特征。 2.职业流行病学调查对OMLDTE病例进行一般情况和职业接触的问卷调查，病例所在的作业场所空气中TCE浓度的测定，病例发病急性期和恢复期的生化、血液常规与尿常规等指标的检查；对63例职业性TCE接触工人进行一般情况和职业接触的问卷调查，工人所在作业场所空气中TCE浓度的测定，工人班后尿中三氯乙酸(Trichloracetic acid，TCA)浓度的测定，皮肤检查、血清AST、ALT以及T-Bil等生化指标的测定。 3.人外周血血清蛋白质双向凝胶电泳(two-dimellsional gel electrophoresis，2-DE)条件的优化建立去除血清高丰度蛋白的方法，并对2-DE的条件，包括聚丙烯酰胺凝胶浓度、IPG胶条的pH范围、蛋白质上样量、银染方法、水化上样液体积、电泳程序参数等进行摸索，得到稳定性高、重复性好的2-DE银染图谱。 4.OMLDTE病例发病急性期和恢复期血清蛋白的2-DE差异分析采用标本混合(sample pooling)策略，运用优化后的2-DE条件对OMLDTE病例发病急性期和恢复期的血清蛋白进行分离。使用PDQuest7.4.0图像分析软件对分离后的2-DE蛋白银染图谱进行差异分析，筛选出有代表性的差异表达蛋白。在部分个体中验证从混合标本中分析得到的差异表达蛋白质。 5.OMLDTE病例发病急性期和恢复期血清差异表达蛋白质的质谱鉴定和功能探讨运用飞行时间串联质谱技术对差异表达蛋白点样品进行MALDI-TOF-TOF MS分析，获得血清差异蛋白点的肽质量指纹图。完成MS后，选择强度最大的4个峰进行串级质谱分析。最后采用联合检索的方式，应用GPS-MASCOT进行NCBInr数据库的联合检索，鉴定该蛋白点为何种蛋白质。查询文献，了解这些差异蛋白的功能，探讨这些差异蛋白在OMLDTE中可能发挥的作用。 6.统计分析方法数据一般用平均数±标准差表示((x)±s)，变异大的数据采用中位数表示；多组之间比较采用方差分析及卡方检验进行统计学分析。 结果： 1.现场职业流行病学调查对比OMLDTE患病人群和职业性TCE接触人群的情况表明：OMLDTE的发生呈现个体特异性，呈典型的免疫变态反应；在相同环境的暴露浓度下只有个别人发病，其它人不发病，提示与遗传易感因素有关；发病与接触的TCE浓度不呈剂量—反应关系，表现为暴露在9.1mg／m3也可以发病，而暴露于1181mg／m3的工人未见发病，发病与暴露浓度不呈规律；病人发病以发热、皮疹、肝损害以及浅表淋巴结肿大为主，部分病例合并肾、眼损害，而在职业性TCE暴露人群中未出现该中毒表现。 2. 2-DE条件的优化人外周血血清中的蛋白质经Qiagen公司生产的Aurum／IgG Depletion Spin Column过滤去除白蛋白和IgG后，应用100～150μg的过滤蛋白质上样，上样缓冲液终体积为350μL泡涨，经pH3-10NL IPG胶条进行等电聚焦(IEF)，继而12％浓度聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，运用Amersham推荐方法加以改进进行银染，配合调整优化其他一些必要的条件，获得比较理想的蛋白质图谱。 3.OMLDTE病例发病急性期和恢复期血清蛋白的2-DE差异分析 3.1 2-DE银染凝胶图谱的重复性分析经过Bio-Rad公司的PDQuest7.4.0软件分析后，获得OMLDTE病例发病急性期和恢复期血清蛋白凝胶的平均蛋白质点数为582±31和595±28。经过背景消减后，将其中的一块胶定为参考胶进行3块胶间蛋白质点的匹配，OMLDTE病例发病急性期血清的2-DE胶间平均匹配的点数为483±29，匹配率达82.9％；OMLDTE病例恢复期血清的2-DE胶间平均匹配的点数为491±27，匹配率达82.5％。说明本实验的2-DE系统重复性较好。 3.2 2-DE图谱的差异分析经软件分析和人工确认pH3-10NL图谱中的差异点发现：仅在OMLDTE病例发病急性期中出现的差异蛋白点共13个；仅在恢复期出现的差异蛋白点只有1个；表达丰度比值在3倍以上的差异蛋白质点共有27个，其中发病急性期表达量为恢复期3倍以上的蛋白点有8个，恢复期表达量为发病急性期3倍以上的蛋白点有19个。经3例个体验证，40个差异表达蛋白点在部分个体均以一定比例出现，只有1个差异表达蛋白点在全部验证个体中均不出现。 3.3标本混合策略的评价通过比较和分析混合标本图谱和个体标本图谱，充分证明本研究采取的标本混合策略是正确的、可行的，通过这种有效的方式，我们可以准确的找出大部分个体所具有的有意义的蛋白质点。 4.血清差异表达蛋白质的质谱鉴定和功能探讨通过MALDI-TOF-MS／MS质谱鉴定蛋白以及肽质量指纹图谱数据库查询分析蛋白的方法，成功鉴定了33个蛋白质。分别为只在急性期表达的S1OOA8、血清淀粉样蛋白A、S1OOA8／S1OOA9、铁蛋白轻链、亮氨酸氨肽酶、肝组织1，6-二磷酸果糖缩醛酶A链、着丝粒蛋白F等；发病急性期比恢复期表达增加的重组血红蛋白A链、Lepore-Baltimore血红蛋白、脂蛋白CⅢ、血浆谷胱甘肽过氧化物酶、载脂蛋白E前体；恢复期比急性期表达增加的视黄醇结合蛋白、人乙酰辅酶A羧化酶、载脂蛋白M、α结合珠蛋白2、α-微球蛋白／bikunin前体、结合珠蛋白、角蛋白1、血红素蛋白前体、羧肽酶N，多肽1前体、人补体C3 B链、人伴肌动蛋白相关锚定蛋白、醛缩酶B等。 本研究分离并鉴定的差异表达蛋白大多数与OMLDTE的发生、发展相关，可能为OMLDTE潜在的效应标志物。 结论： 1.OMLDTE的发生呈现个体特异性，呈典型的免疫变态反应，与遗传易感因素有关；病人发病以发热、皮疹、肝损害以及浅表淋巴结肿大为主，部分病例合并肾、眼损害；TCE职业暴露人群未见该类表现。 2.构建了重复性、稳定性良好的血清蛋白质2-DE平台，优化了血清蛋白质分离的试验条件，为进一步分离、鉴定和分析OMLDTE相关的血清蛋白质研究打下良好基础。 3.采用标本混合策略分离OMLDTE病例血清蛋白质，有效的消除个体差异，降低了分析的复杂性。通过运用部分个体标本验证混合标本结果，确定了混合标本中的差异表达蛋白质大部分均在个体标本中出现，证明了标本处理策略的科学性，为进一步开展OMLDTE病例血清差异蛋白质组学的研究提供了可靠的基础。 4.对OMLDTE病例发病急性期和恢复期混合血清进行2-DE分离和PDQuest软件分析得到了41个差异表达蛋白质，为进一步的质谱鉴定和功能分析奠定了坚实的基础。 5.采用MALDI-TOF-MS／MS成功鉴定了31个差异表达蛋白质，得到了蛋白质肽质量指纹谱图和NCBInr数据库检索结果，为进一步探讨蛋白质的功能、分析蛋白质在OMLDTE的发生、发展过程中发挥的作用提供依据，为从整体水平研究OMLDTE的发病机制提供了重要价值的线索。