基于HepG2细胞的核酸适配体的筛选及其相关应用

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癌症是全球范围内死亡率第二的疾病,肝癌的死亡率在这些癌症中排名第二,每年大约有50%的肝癌新生患者和肝癌死亡患者来自中国。肝癌的手术治疗困难,且术后存活率不高,只有通过早期诊断并及时治疗才能提高肝癌患者的存活率。利用癌细胞与正常细胞的差异性可以实现对肝癌的早期诊断,然而目前的肝癌早期诊断标志物的特异性不强、灵敏度不高,很容易出现漏诊、误诊。本文以肝癌HepG2细胞为靶细胞进行高特异性、高结合力的核酸适配体的筛选,旨在为肝癌早期诊断寻找更好的途径。具体研究内容如下:  1.两条核酸适配体的筛选  我们以肝癌HepG2细胞为靶细胞,人正常肝细胞L02细胞为对照细胞,通过不断增加筛选压力进行了19轮的细胞筛选,最终得到了两条核酸适配体apt_A和apt_B,并用软件模拟出核酸适配体的二级结构。(第二章)  2.核酸适配体的性质考察  我们对这两条核酸适配体的特异性、亲和力以及与实体瘤组织切片的结合能力分别进行了考察。(1)特异性的考察:我们将FAM荧光标记的核酸适配体与不同细胞孵育后,分别用流式细胞仪和共聚焦显微镜检测,这两个实验的结果都证实了我们的核酸适配体特异性比较强。(2)用平衡解离常数Kd值来衡量核酸适配体的亲和力。通过配制一系列不同浓度的核酸适配体与HepG2细胞孵育,并使用流式细胞仪检测每一组实验的平均荧光强度。通过软件进行非线性拟合,确定了apt_A和apt_B的Kd值分别为:46.3±4.5nM和101.8±15.1nM,低于他人针对HepG2细胞筛选所得的核酸适配体的Kd值。(3)在裸鼠的皮下种植HepG2细胞的移植瘤,待瘤长成后取出并制成组织切片。使用荧光FAM分子标记的apt_A和apt_B与组织切片进行免疫荧光实验,最终发现这两种核酸适配体都可与在体内长成的移植瘤特异性结合。(第三章)  3.核酸适配体介导的载药复合颗粒的特异性细胞毒性  将阿霉素药物与不同的核酸适配体结合后,分别对HepG2细胞和L02细胞进行了细胞增殖毒性实验。实验结果显示dox-apt对HepG2细胞的杀伤性很强,而对L02细胞几乎没有影响。同时dox-apt_A和dox-apt_B复合颗粒对细胞的致死率均为50%,而他人所筛选的核酸适配体介导的dox-apt_out对细胞的致死率仅为30%。实验结果表明dox-apt_A和dox-apt_B的特异性杀伤效果很强,强于dox-apt_out(第四章)。
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