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研究目的非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)的病理机制及治疗方案尚未完全明确。本研究在文献调研、分析的基础上,探讨非酒精性脂肪性肝病的中医证治规律及病机特征。基于2种动物模型(蛋氨酸-胆碱缺乏饮食诱导小鼠NASH模型及高脂饲料诱导大鼠NASH模型),评价小檗碱干预NASH的疗效。进而以肝组织巨噬细胞表型转化、胰岛素抵抗及代谢紊乱为切入点,探讨小檗碱干预NASH的分子机制。研究方法1基于SinoMed和PubMed数据库,采用文本挖掘方法,通过数据检索、数据处理、数据分析及可视化呈现技术,挖掘非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)的中医证候特点及用药规律并构建NAFLD相关的生物学网络。基于中医“方-证-病”相关联理论,分析和理解NAFLD中医病机对应的物质基础及可能的干预靶标。2小檗碱干预NASH的药效学研究：C57BL/6小鼠和SD大鼠随机分成5组：正常对照组、模型对照组、阳性药(罗格列酮治疗)对照组、小檗碱高剂量干预组和小檗碱低剂量干预组。采用常规方法制备蛋氨酸-胆碱缺乏饮食(MCD)诱导的NASH小鼠模型(2W)及高脂饮食(HFD)诱导的大鼠NASH模型(8W)。正常对照组喂予普通饲料,其余各组喂予MCD或HFD。小檗碱和罗格列酮以预防性、灌胃给药的方式连续干预。大鼠腹主动脉取血、小鼠摘眼球取血分离血清,肝组织分别液氮固定冰冻切片、多聚甲醛固定制作石蜡切片。采用血清生化、组织病理学、血清炎症因子酶联免疫法(ELISA)等检测方法评价小檗碱干预NASH的疗效。3基于MCD诱导NASH小鼠模型,生理盐水注入左心室进行肝脏灌流,提取肝脏非实质细胞,采用流式细胞术方法检测肝组织中巨噬细胞(F4/80)及M1(F4/80+CD11c+)、M2(F4/80+CD206)亚型的数量,分析M1/M2比值。4基于HFD诱导大鼠NASH模型,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RTFQ-PCR)及免疫组化法(IHC)检测肝组织PPAR-γ mRNA及蛋白表达；采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱法(UPLC-Q-TOF-MS)检测大鼠血清中内源性小分子代谢物(metabolites)轮廓,结合主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)等代谢组学技术分析NASH相关的代谢标志物及代谢通路。5全部定量数据经SPSS17.0统计软件进行分析及统计学处理,数值采用X±S表示,组间均数差异比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA), P<0.05表示差异有统计学意义。研究结果1文本挖掘结果显示,NAFLD中医临床最主要的证候包括：肝郁脾虚、湿热内蕴和痰瘀互结；治疗NAFLD常用的中药包括：丹参、柴胡、何首乌、泽泻、山楂、白术和郁金；NAFLD中医病机对应的生物学过程是胰岛素抵抗、脂代谢调节紊乱及慢性炎症。2NAFLD病理评分结果表明,HFD喂养SD大鼠8周后NAS病理评分6.6分,MCD饮食喂养C57BL/6小鼠2周NAS评分6.8分,表明NASH模型制备成功。在两种NASH模型中,高、低剂量小檗碱预防给药均能显著改善NASH病理改变程度；降低血清ALT、CHO水平(P<0.05)；下调促炎因子TNF-a而上调抗炎因子IL-10水平(P<0.05)。结果提示：小檗碱干预NASH的疗效与阳性药(罗格列酮)相当,且高、低剂量组间差异不显著(P>0.05)3流式细胞术结果表明,与正常对照组比较,MCD诱导NASH小鼠肝组织中M1型巨噬细胞数量显著增高,M2型巨噬细胞数量显著降低,M1/M2比值显著增加(P<0.01)；与模型组比较,小檗碱干预组小鼠肝组织中M1数量减少,M2数量显著增多(P<0.05),M1/M2比值显著降低(P<0.01)。结果提示：小檗碱和罗格列酮均能改善MCD饮食诱导的NASH病理过程,其作用可能是通过调节巨噬细胞的表型转化,即升高肝组织中的M2、降低M1的比例。4免疫组织化学结果表明,与正常对照组比较,HFD诱导NASH大鼠肝组织PPAR-y蛋白水平显著下调(P<0.01)。小檗碱和罗格列酮均能显著上调肝组织中PPAR-γ蛋白的表达(P<0.01)。而RTFQ-PCR结果表明,HFD诱导NASH大鼠肝组织PPAR-γmRNA水平显著上调(P<0.01)。与之相应,小檗碱和罗格列酮均能显著下调肝组织中PPAR-γmRNA的表达(P<0.01)。结果提示：小檗碱对HFD诱导的NASH大鼠改善IR、减轻病理程度可能是通过某种途径纠正了PPAR-γ基因转录至翻译的环节。5UPLC-Q-TOF/MS检测结果表明：大鼠血清中可获取1494个离子峰(正离子模式下870个,负离子模式下624个)。PCA及PLS-DA结果表明正常对照组、NASH模型组、罗格列酮干预组及小檗碱干预组呈明显的聚成3簇,罗格列酮和小檗碱组的代谢产物呈现明显的重叠模式。多元分析(VIP>1)结果表明,与正常对照组比较,NASH大鼠血清中可筛选获得57个潜在的生物标志物：包括下调的肌酐、乙酰肉碱、苯丙氨酸、酪氨酸、硫酸吲哚酚、胆酸、熊去氧胆酸、花生四烯酸、15羟基二十碳四烯酸、3-Hydroxychola-7,22-dien-24-oic acid、鞘磷脂(SM34:1,34:2,36:1,40:1,42:1,42:2,42:3)、磷脂酰胆碱(PC32:0,34:0,36:3,37:4,38:4,38:6,40:4,40:5,40:6,40:8)、溶血卵磷脂(LPC16:0,17:0,18:0,20:4)和二酰甘油(DG38:6)上调的13过氧氢十八碳二烯酸(13-HpODE)、11,12亚甲基十九碳酸、二十碳烯酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二十二碳烯酸、溶血磷脂酰胆碱(LPC14:0,16:1,17:1,18:1,18:2,20:2)、磷脂酰胆碱(PC34:1,34:3,34:4,35:2,36:1,36:2,36:4,36:5,38:2,38:3,38:4)和二酰甘油(DG34:2,36:3)。代谢通路分析结果显示：NASH中脂肪酸p氧化、磷脂-花生四烯酸代谢网络以及苯丙氨酸-酪氨酸-甲状腺激素合成代谢、胆固醇-胆汁酸代谢被扰动；小檗碱与罗格列酮使NASH病理状态下紊乱的代谢轮廓向正常状态偏移。研究结论现代中医对NAFLD已有系统的研究,基于中医“方-证-病”相关联理论,该病的物质基础与胰岛素抵抗、炎症及代谢紊乱等生物学过程相关。小檗碱能有效抵抗HFD诱导大鼠及MCD饮食诱导小鼠NASH的形成,其初步药理机制包括以下3个方面：1小檗碱可调节肝组织中巨噬细胞表型转化,抑制M1型巨噬细胞、增加M2型巨噬细胞的比例,下调促炎细胞因子、上调抗炎细胞因子的合成和分泌,从而抵抗NASH的发生、发展。2小檗碱显著改善机体的胰岛素抵抗,其部分药理机制通过调节PPAR-γ基因的转录和表达。3代谢组学结果提示：小檗碱干预NASH,通过影响脂类和蛋白质多个代谢通路调节代谢紊乱,而且其对代谢谱的调控与罗格列酮相近。该研究结果区分于以往的“单—药物-单—靶点-单—信号通路”的药理机制研究模式,从系统和整体水平揭示了中药单体化合物小檗碱的分子药理机制。小檗碱干预NASH的靶点呈非线性特点,通过影响多个通路如胰岛素抵抗、炎性因子、代谢紊乱等改善NASH的多个病理环节。该研究为小檗碱深度开发为抗脂肪性肝炎药物提供了实验资料和新的研究策略。