前言 诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)催化合成的过量的一氧化氮(nitric oxide，NO)能引起广泛的组织损伤，并参与噪声、耳毒性药物、缺血、炎症等原因造成的耳蜗病理过程。对iNOS的抑制能减轻多种原因引起的内耳损害。研究发现，水杨酸钠能抑制离体肝细胞、心肌纤维母细胞、血管平滑肌细胞中iNOS的表达，提示水杨酸钠有可能通过对iNOS的抑制发挥在内耳的保护作用。本实验采用免疫组化方法观察水杨酸钠对细菌内毒素(lipoplysaccharide，LPS)引起的大鼠耳蜗iNOS表达的影响，并探讨水杨酸钠对耳蜗的保护性作用。 材料和方法 材料：取耳廓反射正常、体重250-300g的健康雄性Wista大鼠24只，耳显微镜检查鼓膜排除中耳炎。所有动物平均分为3组，分别为LPS组、NaSA／LPS一组和NaSA／LPS二组。经鼓膜向右侧鼓室注射浓度为5mg／ml的LPS0.5mg，左侧鼓室注射等量生理盐水。NaSA／LPS一组和NaSA／LPS二组动物在注射LPS前4小时分别经腹腔注射水杨酸钠200mg／kg和400mg／kg。LPS组动物腹腔注射等量生理盐水。方法：(1)ABR检测：在注射LPS前、注射后12、24小时测试ABR反应阈。备选动物在2％戊巴比妥钠40mg／kg腹腔注射麻醉下，在隔音的电屏蔽室内常规方法测试ABR，记录反应阈。用Danac-7型声刺激器行短声(click)刺激，频率20次／秒，扫描时间10ms，滤波100-3000Hz，声输出范围0-100dB，信号叠加128次，以ⅡⅢ波反应阈为标准判断听阈。＊）免疫组织化学检查：于注射LPS后每次检测ABR后每组取4只动物处死。麻醉下开胸，4℃生理盐水经心脏灌流，冲出全部红细胞后4％多聚甲醛灌流固定。断头，快速取出听泡，分离出耳蜗，蜗尖打孔，开放圆窗。卵圆窗，将耳蜗置于相同固定液中24／J＼时。甲酸一甲酸钠溶液脱钙一周，每日更换脱钙液。再移人30％蔗糖溶液4℃下过夜。OCT包埋，沿蜗轴平行方向行10Pm厚切片准备作免疫组化染色瞩ABC法人待切片在空气中干燥后，人3％过氧化氢溶液10分钟去除内源性过氧化物酶；正常山羊血清室温20分钟封闭；加一抗（兔抗鼠iNOS单克隆抗体人4℃过夜；再加二抗（生物素化羊抗兔 IgG入室温孵育 20分钟后加链霉亲和素一生物素一过氧化物酶复合物（咖PM10n－M。611－PP roiloi4PPC。mpl。，SABC乃7t反应 20分钟；二氨基联苯胺显色，光镜下控制反应时间，蒸馏水终止显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。空白对照用PBS代替一抗，其余步骤不变。采用Meta Morph电子计算机图像分析系统，测定iNOS阳性反应物的平均灰度值，以均数上标准差表示，灰度值越大，说明组化反应程度越低。各组ABR反应阈也以均数上标准差表示，用SAS统计分析软件对结果进行方差分析，比较差异的显著性。 结 果 ＊注射Li的右耳ABR反应阈明显升高，其中以L．e组最为显著，NaSA／脱一、二组的听阈升高明显低于Li组，经单因素方差分析并行q检验发现，LPS组与NaSA／LPS一、二组的ABR阈移相比差异具显著性O＜o．05人＊拐A／肥一、二组之间＊＊R阈移差异无显著性。左耳注射生理盐水后，ABR阈值略升高，但各组之间比较差异光显著性。 2．注射e后，光学显微镜下观察，在耳蜗螺旋韧带、血管 ·2·纹、螺旋神经节、柯替氏器的支持细胞等处有明显的iNOS表达，以LPS组表达最强，NdA／肥一组其次，N aSA／aSA／班二组最弱，只注射生理盐水的对侧耳蜗各部位无iNOS表达。图象分析表明：NaSA／m一、二组耳蜗iNOS阳性反应的平均灰度值明显高于册组，经统计分析差异显著（单因素方差分析，P＜o．05人即NaSA／m一、二组耳蜗iNOS活性明显低于LPS组。 讨 论 鼓室内注射细菌LPS引起实验动物听力下降，伴有耳蜗iNOS表达增强，提示NO可能参与炎症过程引起的耳蜗损伤；预先注射NaSA后，由LPS引起的ABR反应阈上移程度有所减轻，同时iN－OS的表达亦减弱，证明NaSA对LPS引起的耳蜗损伤具有一定的保护作用，这种保护作用可能与抑制iNOS的表达有关。 目前已知生物体内有三种亚型的NOS，即神经元型hNOSX内皮型＊NOS）和诱导型ONOSX其中前两型为结构型＊NOS人生理状态下即存在，催化少量的NO合成，参与神经传递、血流调节和免疫反应等生理活动。iNOS一般情况下不表达，在受到LPS、肿瘤坏死因子等因素刺激时开始表达，其活性是其他两种亚型的千倍以上，能催化合成大量的NO，对细胞组织产生毒性作用。 已有研究表明耳蜗中iNOS表达及其催化的过量NO合成对耳蜗的听觉功能能产生抑制性影响。耳蜗在受到LPS、肿瘤坏死因子刺激时可见iNOS表达，耳毒性药物如庆大霉素＊ 铂等也能引起耳蜗iNOS表达，在噪声性聋的动物模型中也能见到耳蜗中有 iNOS表达，而应用 NOS的抑制剂如 N一硝基一L一精氨酸队一NNA人J一硝基一精氨酸甲酯等能减轻缺氧或耳毒性药物引起的听功能减退，说明上述条件下耳蜗iNOS表达和NO合成参与了耳