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研究目的：构建携带胰岛素样生长因子2印迹(IGF2 Imprinting)系统的重组腺病毒,探讨其用于靶向治疗人结直肠癌(colorectal cancer, CRC)细胞株的可行性。研究方法：(1)使用PCR扩增人源IGF2 Imprinting相关的结构元件,包括H19启动子序列、enhancer及CTCF片段,并将其克隆到pDC-312载体中,最终构建IGF2Imprinting系统；(2)从质粒TopK和pEGFP-C1 vector中分别扩增出E1A和EGFP片段,并将其插入到含有IGF2 Imprinting系统的重组质粒中,用于构建重组腺病毒穿梭质粒；(3)Topl0感受态细胞通过扩增和纯化,将腺病毒穿梭质粒pDC312-E1A,骨架质粒Ad5通过脂质体Lipo2000共转染到人胚肾细胞(HEK293)中,包装成具有感染能力的腺病毒Ad-H19-CTCF-enhancer-E1A和Ad-H19-CTCF-enhancer-EGFP,分别命名为Ad312-E1A和Ad312-EGFP;(4)利用腺病毒Ad312-EGFP分别感染IGF2印记丢失(IGF2 LOI)的结直肠癌细胞HT-29和HCT-8及IGF2印迹正常(IGF2 MOI)的结直肠癌细胞SW480和正常人胃粘膜上皮细胞株GES-1,通过荧光显微镜观察不同细胞中EGFP的表达情况；(5)使用已上市的溶瘤腺病毒H101作为阳性对照,将Ad312-E1A和H101感染不同的细胞株,48 h后采用RT-PCR和Western Blot分别从转录和翻译水平检测各组细胞中E1A的nRNA及其蛋白的表达量；同时,采用CCK-8法和流式细胞仪用以检测腺病毒Ad312-E1A的体外杀伤肿瘤效应；(6)构建裸鼠腋下移植瘤模型,验证Ad312-E1A的体内杀伤肿瘤效应。研究结果：(1)成功转染了穿梭质粒pDC312-E1A和骨架质粒Ad5到HEK293细胞中,EGFP在48 h表达最强；10-13 d,细胞病变效应为阳性结果,通过3轮病毒的扩增达到了合适的病毒滴度(1×109 pfu/ml);(2)利用重组腺病毒Ad312-EGFP分别感染不同的细胞株,48 h观察,IGF2 LOI的细胞株(HT-29, HCT-8)出现了明显的荧光,即表达了EGFP;(3)利用重组腺病毒Ad312-E1A分别感染不同的细胞株,48 h后发现E1A的mRNA和蛋白仅仅在IGF2 LOI细胞(HT-29、HCT-8)中表达；与正常对照PBS组相比,72 h后10 pfu/cell感染的IGF2 LOI细胞(HT-29、HCT-8)增殖活力分别下降(69.7±5.7)%和(65.2±7.1)%,凋亡率达到(33.4±4.1)%和(29.5±2.7)%；溶瘤腺病毒H101感染细胞株后,仅在p53突变的IGF2 LOI细胞(HT-29)中出现E1A mRNA和蛋白表达,72 h后10 pfu/cell感染的HT-29细胞增殖活率下降(59.4±2.4)%,凋亡率为(38.6±3.2)%；(4)多点注射PBS、Ad312-EGFP、H101和Ad312-E1A治疗HT-29细胞种植的裸鼠移植瘤,结果显示腺病毒H101和Ad312-E1A均能有效的抑制肿瘤的生长并改善其预后。结论：(1)本研究成功的构建了携带IGF2 Imprinting系统和腺病毒复制基因E1A的重组腺病毒；(2)重组腺病毒Ad312-E1A在体内外均能有效的杀伤抑制IGF2 LOI的人结直肠癌细胞；(3) Ad312-E1A可以作为靶向治疗CRC的一个新途径,从而为CRC的基因靶向治疗提供新思路。