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目的: 1.研究开发快速、灵敏、选择性强的蛋白质荧光检测方法,为聚丙烯酰胺凝胶上蛋白质的检测提供合适的方法; 2.探究凝胶上蛋白质的检测机理,阐明荧光染料与蛋白质的相互作用,探讨其作用方式和作用机理,将有助于人们从分子水平上了解检测机制。 方法: 1.蛋白质荧光检测方法:通过对现有的一维和二维凝胶进行不同染色方法进行比较,如水杨醛吖嗪(SA)染色、曙红负染法、SYPRO Ruby染色法、GA-银染法,建立最快速、灵敏、选择性强的荧光染色方法;2.为了能更深入的研究荧光检测的机理,通过分子模型研究、LC-MS/MS等多种研究手段来共同探究荧光染料与蛋白质的相互作用,比较不同染色方法的优缺点。 结果: 1.水杨醛吖嗪(SA)染色蛋白质检测方法的特性及优化 (1)固定:凝胶放入固定液中固定20分钟,固定液由40%乙醇与20%乙酸组成; (2)水洗:凝胶用去离子水洗两次,每次洗5分钟; (3)染色:凝胶在50ml染色液中染色5分钟,染色液组成为25μ M SA,10mMNaOH溶液; (4)脱色:凝胶放入1%乙酸溶液中脱色5分钟;再将凝剂放入0.2%硼酸钠、0.5%碳酸钠溶液中脱色20分钟。 2.通过与3种方法(曙红负染法、SYPRO Ruby染色法、GA-银染法)的比较,显示SA法的灵敏度达0.2-0.4ng,是SYPRO Ruby染色法的四倍,与GA-银染法一致。 3.通过分子模型研究、LC-MS/MS研究手段来共同探究荧光染料与蛋白质的结合是通过氢键与疏水性力,且SA染色法与质谱的兼容性良好。 结论: 水杨醛吖嗪(SA)无论在一维和二维聚丙烯酰胺凝胶电泳中均可作为敏感染料,SA蛋白质荧光染色法可在1小时内完成操作,灵敏度达0.2-0.4ng,是SYPRO Ruby染色法的四倍,与GA-银染法一致。此法具有灵敏、快速、质谱兼容性好等优点,适用于当前飞速发展的蛋白质组学研究。