论文部分内容阅读
背景：肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一,目前针对其早期诊断及分子靶向治疗的研究日渐成为研究中的热点。HCC的形成(?)展受遗传学机制(genetic mechanism)和表观遗传学机制(epigenetic mechanism共同调控,是一种多基因共同参与的级联调控过程,最终导致癌基因的激活或抑癌基因的失活。表观遗传学指不发生DNA序列改变的基因表达改变,DNA甲基化和组蛋白修饰是其中的两个主要内容。近年来研究显示,人类肿瘤的发生、发展与DNA甲基化异常有关,特异基因的甲基化检测可以作为癌症早期诊断的分子标记物、治疗的靶点和判断预后的手段。3-O-硫基转移酶-2(heparan sulfate D-glucososaminyl3-O-sulfotransferase-2,3-OST-2)基因表达缺失致使硫酸乙酰糖蛋白修饰不完全,与肿瘤发展有密切关系,但是具体机制尚不清楚。DNA甲基化往往与组蛋白修饰相互作用共同调控基因的表达。比之DNA甲基化,组蛋白修饰的调控更为复杂,不同组蛋白中的不同氨基酸可以发生多种不同类型的修饰,其中组蛋白乙酰化和去乙酰化是组蛋白修饰中的重要内容。新近的研究发现,UHRF1不仅可通过DNA解螺旋酶识别甲基化位点,在确保DNA甲基化的正确复制中起重要作用,还能识别甲基化的组蛋白,具有双重识别DNA和组蛋白甲基化的功能,但UHRF1如何调控抑癌基因表达,在肝细胞癌中发挥怎样的作用目前尚不清楚。目的：探讨3.OST-2启动子甲基化在HCC发生发展中的作用及机制,检测DNA甲基化转移酶(DNA methyltrasferases, DNMT)抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-dC)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDAC)抑制剂曲古菌素A (trichostatin A, TSA)对HCC细胞株中3-OST-2基因启动子区甲基化水平、基因表达以及对核转录因子UHRF1的影响。方法：培养HCC细胞株,实验分为4组：(1)未加药HCC细胞株对照组;(2)5-Aza-dC单独处理组；(3)TSA单独处理组；(4)5-Aza-dC+TSA联合处理组。采用甲基化特异性PCR (methylation-specific polymerase chain reaction, MSP)法检测药物作用前后HCC细胞株中3-OST-2启动子区甲基化的状态改变,实时荧光定量PCR(Real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)法检测3-OST-2和UHRF1mRNA的表达变化,采用Western blotting和细胞爬片免疫组化法检测不同处理组UHRF1蛋白的表达变化。结果：3-OST-2在HCC细胞株中呈完全甲基化状态,5-Aza-dC或TSA单独均能部分逆转3-OST-2甲基化,mRNA表达分别增加2.7倍和4.9倍,两药联合处理后,3-OST-2甲基化被完全逆转,mRNA表达增加9.1倍。5-Aza-dC或TSA均能降低UHRF-1mRNA和蛋白表达,TSA比5-Aza-dC疗效更好(P<0.01),两药联用具有协同作用(P<0.01)。细胞爬片免疫组化结果显示,UHRF1蛋白在HCC细胞株中阳性表达率较高(94%),经5-Aza-dC处理后UHRF1蛋白表达阳性率降低为69%；与未加药HCC细胞株对照组相比,差别在统计学上有意义(P<0.01)。而TSA处理后UHRF1蛋白表达显著下降,阳性率为35%,抑制UHRF1蛋白效果明显好于TSA(P<0.01);两种药物联合处理后,UHRF1蛋白阳性率降为27%。Western blotting结果表明两种药物均可抑制UHRF1蛋白表达,两药联用效果更为明显。结论：3-OST-2基因表达降低在HCC中发挥重要作用。其表达受启动子区甲基化和组蛋白去乙酰化共同调控。UHRF1参与了3-OST-2基因表达调控通路中DNA甲基化和组蛋白去乙酰化之间的相互作用,并且对组蛋白乙酰化的调控作用大于对DNA甲基化的调控作用。