定向诱导的骨髓间充质干细胞移植治疗皮质脊髓束Waller变性的初步研究

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目的:本实验拟采用定向诱导的骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)移植治疗皮质脊髓束Waller变性,力图阐明BMSCs移植治疗皮质脊髓束Waller变性的可行性及其机制。  方法:(1)采用密度梯度离心+贴壁法培养、纯化BMSCs,取第三代BMSCs经过bFGF预诱导24小时、丹参酮ⅡA诱导24小时后,采用免疫细胞化学染色法进行鉴定。细胞移植前48小时以5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记诱导后的BMSCs;(2)采用选择性左侧锥体横断建立皮质脊髓束Waller变性动物模型,通过Rivlin斜板试验、BBB评分、HE染色、镀银染色、BDA示踪及透射电镜观察超微结构的改变确定模型的成功建立;(3)将大鼠分为正常组、假手术组及模型组,模型组大鼠随机分为生理盐水移植组、局部细胞移植组和蛛网膜下腔细胞移植组。将各组大鼠进行Rivlin斜板试验、运动功能BBB评分判断神经功能恢复情况,进行HE及镀银染色观察神经纤维损伤及再生情况,并应用免疫组化染色、Western blot及透射电镜检测移植细胞的存活、分化情况及损伤部位神经纤维的再生情况。  结果:(1)在体外扩增培养的BMSCs增殖速度快,扩增能力强,第三代BMSCs形态均一,呈单层生长,胞体多呈长梭形,呈旋涡状排列,通过bFGF预诱导,丹参酮ⅡA诱导后能表达NSE及Nestin神经元标志物;(2)①建模后各组时间点BBB评分及Rivlin斜扳试验表明:模型组与假手术组及正常组比较,差异有统计学意义;②HE及镀银染色结果显示:模型组神经纤维紊乱,胶质瘢痕增生及空洞形成,而正常组与假手术组则无明显变化;③BDA顺行示踪观察正常组两侧锥体均有较多示踪剂,而模型组损伤侧下端几乎未见示踪剂,对侧锥体可见较多荧光示踪剂;④透射电镜可观察到模型组轴突和髓鞘的病理改变,如轴突肿胀、轴浆稀少、轴索扭曲变形、髓鞘松解、结构不规整等;(3)①局部移植组及蛛网膜下腔移植组 BBB评分及Rivlin斜扳试验结果均高于生理盐水移植组,局部移植组与蛛网膜下腔移植组相比较差异有统计学意义(P<0.05);②HE及镀银染色结果显示各组均有不同程度的恢复;③免疫组化及Western blot结果显示:局部移植组及蛛网膜下腔移植组与生理盐水移植组相比较有显著差异(P<0.01),局部移植组与蛛网膜下腔移植组相比较,差异有统计学意义;④透射电镜观察局部及蛛网膜下腔移植组髓鞘结构较规整,神经元胞体较生理盐水组增大,胞质丰富,细胞器增多,线粒体嵴数目增多,大量的粗面内质网聚集成束,排列规整。  结论:(1)体外成功培养BMSCs,bFGF+丹参酮ⅡA能够诱导 BMSCs分化为神经元样细胞;(2)诱导后的BMSCs移植能有效改善皮质脊髓束 Waller变性区域微环境,提高 MBP及NF-200的表达,抑制 GFAP的表达,促进轴突再生与髓鞘化,抑制胶质瘢痕的形成,促进神经功能的恢复。
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