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流感病毒是人兽共患病的病原之一,流感的不断暴发对人类健康和养殖业造成巨大的危害及损失。流感病毒在宿主体内的复制过程是一个病毒与宿主相互博弈的过程,病毒的复制过程需要宿主蛋白的协助,而机体为了对抗病毒的入侵也衍生出多种机制。流感病毒基因组的转录和复制是以病毒核糖核蛋白复合物（vRNP）作为基本单位进行的,而这一过程需要依赖宿主蛋白的参与。因此,研究宿主蛋白与流感病毒之间的相互作用可以进一步阐述其致病机制,也为宿主来源的抗流感病毒药物靶标的发现提供理论依据。本研究通过Co-IP实验证实了宿主蛋白增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）与流感病毒PR8的聚合酶亚基PB2存在相互作用。进一步研究表明宿主蛋白PCNA与PB2的互作影响PB2的入核过程,抑制病毒聚合酶复合物的组装,最终抑制病毒的复制。主要研究内容如下:1宿主蛋白PCNA与PR8聚合酶亚基PB2互作,抑制病毒复制本研究利用Co-IP实验证实了在293T细胞上过表达PCNA和PB2后发现二者存在相互作用;也证实了在流感病毒感染细胞时内源性的PCNA也与病毒的PB2蛋白存在相互作用。在A549细胞上过表达或沉默PCNA后,用PR8病毒（MOI=0.01）感染细胞,在12h、24h和36h收取细胞上清和细胞蛋白样品。结果表明过表达PCNA后PR8病毒的滴度(TCID50)相较于对照组下降了1～1.5个病毒滴度,而沉默PCNA后能显著增加PR8病毒的复制水平。过表达组和沉默组的实验结果表明,PCNA是PR8流感病毒复制的限制因子之一。2 PCNA对PR8病毒聚合酶复合物组装的影响在293T细胞上过表达PR8病毒的聚合酶转录系统时发现,PCNA能显著抑制PR8病毒的聚合酶活性,且呈剂量依赖性;而沉默内源性的PCNA后,能显著增加PR8病毒的聚合酶活性。病毒的聚合酶活性依赖其最小转录复制单位vRNP的正确组装,PCNA与vRNP复合物的亚基PB2存在相互作用,而且还影响vRNP的活性。这提示PCNA可能通过与PB2的互作来影响聚合酶复合物的组装,从而影响病毒的复制。本研究在293T细胞上体外构建vRNP复合物,其中使NP蛋白携带HA标签,以NP为诱饵蛋白,通过Co-IP实验检测垂钓到的PA蛋白来表明vRNP复合物的组装情况。发现过表达PCNA时,NP垂钓到的PA的量减少而且呈剂量依赖,这表明PCNA可以抑制病毒聚合酶的组装过程。vRNP是由NP蛋白包裹v RNA与聚合酶蛋白（PA、PB1和PB2）形成,已知PA与PB1形成二聚体入核,NP和PB2借助转运蛋白家族蛋白单独入核,然后在细胞核内形成复合物,与病毒相关RNA组装成vRNP和c RNP复合物,来完成新一轮的转录和复制。其中PCNA与PB2的相互作用抑制了聚合酶的组装,有可能是干扰PB2的入核过程。接下来,为了验证这一猜想,利用竞争Co-IP实验发现PCNA存在时,转运蛋白家族蛋白（importinα1、importinα5和importinα7）能垂钓到的PB2减少,结果表明:PCNA能与importinα家族蛋白竞争结合PB2,从而影响PB2的入核过程。间接免疫荧光实验发现在He La细胞上过表达PCNA和PB2时,PCNA能够增加PB2的胞质滞留,这一结果也佐证了PCNA竞争impotinα家族蛋白与PB2的互作。3 PCNA与PB2互作的区域PB2的入核过程是由importinα家族蛋白介导的,importinα蛋白通过识别货物蛋白的核定位信号并与之结合形成二聚体,二聚体在importinβ转运蛋白的参与下通过核孔复合物入核。接下来,我们构建了PB2的核定位信号突变体和核定位信号缺失体,并验证PB2突变体及缺失体的核质分布,与野生型PB2相比,发现PB2（738Q、KNRQ、8/K和ΔNLS）在胞质中明显增多,这验证了736～755aa是PB2的核定信号区域的结论。通过Co-IP实验我们发现,PCNA与PB2的核定位信号突变体之间的相互作用明显减弱,738Q与PCNA之间的相互作用几乎完全消失。4病毒感染下调PCNA的表达但并不影响PCNA的核质分布在A549细胞上接种不同稀释倍数的PR8流感病毒,在接毒12h后,收取蛋白样品,发现PR8流感病毒可以下调内源性PCNA的表达,且随着接毒剂量的增大,PCNA的表达水平下降越明显。同时,在293T细胞上过表达Flag标签的PB2质粒,转染24h后,检测内源性PCNA表达量的变化,与空载相比发现内源性PCNA的表达量也下降,且随转染PB2质粒的量的增多,PCNA的减少越明显。这暗示流感病毒PR8下调宿主蛋白PCNA的表达量可能是通过病毒蛋白PB2来介导的。我们还发现PR8病毒感染A549细胞后并不影响PNCA的核质分布,无论是感染或不感染PR8病毒,PCNA主要是存在于胞核,胞质中也有少量分布。本研究初步阐明了PCNA抑制流感病毒复制的分子机制,发现PCNA与PB2之间的相互作用影响了importinα家族蛋白对PB2的识别来抑制PB2的入核过程,从而抑制了流感病毒聚合酶复合物的组装,最终抑制了流感病毒的复制。