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达托霉素对包括MRSA、VRE等耐药菌在内的大多数革兰氏阳性菌都有很强的抗菌活性,链霉菌HCCB10043能够产生达托霉素的先导化合物A21978C。因此对其进行基因改造获得高产达托霉素突变株具有重要意义。本论文选取经转录组分析获得的七个可能具有调控作用的基因:tfpA、arpA、afpA、dgkA、mfpA、asnC及lfpA基因,运用同源重组的方法在HCCB10043中进行基因敲除,并运用回补与过表达实验加以验证;并将研究结果应用在高产菌株的构建中。1、应用温敏型穿梭质粒pKC1139为载体,构建7个基因的敲除质粒,并将其接合转移入HCCB10043中,通过单交换、双交换筛选验证,成功构建了△tfpA、△arpA、△afpA、△dgkA、△mfpA、△asnC及△lfp4敲除突变株。应用pLYW2质粒为载体,构建相应的回补质粒;应用具有oriT的pWHM3质粒pWHM3-oriT为载体,构建相应的过表达质粒;并将它们分别接合转移入各自的敲除突变株和HCCB10043中,成功构建了各自的回补与过表达菌株。2、运用HPLC对各突变株发酵液分析,与亲株HCCB10043相比,发现△tfpA、△mfA、△asnC及△lfpA突变株A21978C产量提高,因此推断它们具有负调控作用;而△arpA、△afpA、△dgkA突变株使A21978C产量降低,因此推断它们具有正调控作用;并通过回补与过表达菌株发酵分析结果得以验证。同时运用UPLC-MS技术分析缺失突变株发酵液,没有发现新的化合物生成,但发现它们对于arylomycin的合成有一定的影响。3、将成功构建的6个基因敲除质粒接合转移入高产菌株A9中,通过单交换、双交换筛选验证,成功构建了它们在A9中基因缺失突变株;其中对arpA基因过表达质粒也接合转移到A9中,构建在A9中的过表达突变株。获得了产量较A9更高的突变株LYPLA141、LYPLA96、LYPLA243、LYPLA158 及 LYPLAG260,其结果更加确定每一个家族基因所行使的作用。4、运用RT-PCR技术对其中的tfpA和mfpA基因的上下游基因及A21978C生物合成基因簇中相关基因的转录情况进行了分析,结果显示,与亲株HCCB10043相比,dptM基因的表达增加,而其上下游基因的转录没有显著差别,说明tfpA和mfpA基因的转录与dptM有关,即达托霉素的外排有关;同时发现aryA基因的表达也增加,说明tfpA和mfpA基因的转录与arylomycin的合成有关。