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基因沉默是生物体长期以来形成的一种防御机制,阻止外源基因、转座因子、病毒等外源核酸的侵入,保护生物基因组的完整性。小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)和微小RNA(microRNA, miRNA)是两种序列特异性地转录后基因表达的调节因子,是沉默RNA的最主要组成部分。RNA介导的病毒抗性(RNA mediated virus resistance, RMVR)是RNA沉默的一种表现形式,侵入植物细胞的病毒基因组与转基因转录产物具有部分同源性,因此在转录后基因沉默所导致的RNA降解过程中,RNA降解系统识别侵入细胞内的病毒基因组并将其与转基因RNA一起降解。RMVR具有抗病程度高(近乎免疫)、抗性持久、生物安全性高等优点。在基因沉默的研究中已发现“位置效应”的存在,siRNA的有效性可能受到靶序列所处的位置影响。在RNA介导的植物病毒抗性研究中,目前尚未见有关“位置效应”的系统报道。本研究以马铃薯Y病毒外壳蛋白为靶基因分别以hpRNA和人工的miRNA两种方式构建RNA干扰的植物表达载体,系统性的比较PVY CP基因不同区段对RNA介导的病毒抗性的影响,为寻找引发基因沉默的有效片段及更好利用RMVR培育抗病毒转基因植物提供了依据。研究结果和主要结论如下:(1)马铃薯Y病毒CP基因不同区段对发夹RNA介导的病毒抗性的影响将PVY CP基因人工的划分为16段各50bp的区段。通过PCR扩增,得到相应的不同区段的正向和反向的片段,通过酶切连入植物表达载体pROKⅡ中;热激法转化大肠杆菌DH5α,筛选并获得hpRNA结构的植物表达载体pROK CPs(pROK CP9~pROK CP16)。用成功构建的16个植物表达载体(另外8个为吴斌构建)瞬时侵染本生烟验证其有效性,Northern Blot结果显示,16个植物表达载体均能在植物体内成功表达产生siRNA,且瞬时表达的siRNA能有效地下调靶基因PVY CP的表达。将构建的8个植物表达载体利用冻融法导入农杆菌LBA4404。叶盘法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选和PCR检测确定转基因植株。T0代转基因植株自交,种子置于含卡那霉素的筛选培养基上进行筛选,共得到的pROK CP9~pROK CP16各50株、62株、56株、55株、45株、63株、72株和55株T1代转基因植株。抗病性分析发现除了转基因株系pROK CP1、pROK CP2、pROK CP3、pROK CP4未获得抗性植株外,其余12个转基因株系中抗性植株的比例分别为27.15%、6.27%、67.65%、70.83%、66.01%、61.34%、66.04%、23.59%、11.11%、55.56%、77.78%和67.25%。结果表明在利用hpRNA介导的抗PVY病毒的研究中,以PVY CP基因上的50bp序列为茎足以介导宿主植株的基因沉默的产生,但由于hpRNA靶位置的差异产生不同的抗病效率,靶向于3′端nt701~nt750区段表现最高水平的抗性;且以CP基因3′端为靶序列的hpRNA转基因植株比以5′端为靶序列的植株更能有效地介导对PVY的抗性。转基因植株的Northern杂交分析表明,转基因都在RNA水平上得到了表达,抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株,抗性与RNA积累量呈负相关,证实病毒抗性是由RNA介导的;对转基因植株的siRNA表达量的分析,表明植株对病毒的敏感程度与siRNA积累量之间没有明显的相关性。对T2代的转基因植株的抗病性分析结果发现,几乎所有的抗性转基因植株的后代均表现很强的抗病毒侵染能力,说明由hpRNA介导的PVY抗性在T2代植株中能够稳定遗传。(2)马铃薯Y病毒CP基因不同区段对人工的miRNA介导的病毒抗性的影响以PVY CP基因的全长cDNA序列为靶基因,根据miRNA的特征选取8个不同的位置,M1(nt96~nt115)、M2(nt140~nt159)、M3(nt322~nt341)、M4(nt380~nt399)、M5(nt475~nt494)、M6(nt567~nt586)、M7(nt679~nt698)和M8(nt735~nt754)为amiRNA的靶区。选用拟南芥miR319a前体作为amiRNA表达的骨架,通过PCR扩增的方式替代掉原有的pre miR319a中具有生物学功能的miRNA和miRNA*,得到含有amiRNA和amiRNA*的DNA片段。将扩增产物连入植物表达载体pROKⅡ中。热激法转化大肠杆菌DH5α,筛选并获得重组表达载体pROK amiRcp1~pROK amiRcp8。用构建的amiRNA表达载体瞬时侵染本生烟,Northern Blot验证其有效性,结果显示,8个amiRNA植物表达载体均能在植物体内成功表达amiRNA,且瞬时表达的amiRNA能有效地下调靶PVY CP基因的表达。将成功构建的amiRNA表达载体利用冻融法导入农杆菌LBA4404。叶盘法转化烟草NC89。再生植株经卡那霉素抗性筛选和PCR检测确定为转基因植株。T0代自交后,经卡那霉素筛选和PCR鉴定,分别获得pROK amiRcp1~pROK amiRcp8的T1代转基因植株98株、96株、114株、116株、117株、111株、110株和116株。抗病性结果显示,表达靶向于马铃薯Y病毒CP基因的amiRNA转基因植株能介导对马铃薯Y病毒的抗性,抗性比例分别为37.68%、50.29%、53.76%、37.75%、29.86%、17.05%、26.27%、64.69%。针对马铃薯Y病毒CP基因不同区段设计的amiRcps其转基因植株所介导的抗病性效果之间存在差异,靶向于3′端的amiRcp 8(nt735~nt754)能表现更高水平的抗性。转基因植株的Northern杂交分析表明,转基因都在RNA水平上得到了表达,且植株的抗性与转基因的表达量成负相关,表明amiRNA介导的病毒抗性是由RNA介导的。对转基因植株的amiRNA的Northern Blot分析,结果显示,所有抗病转基因植株中都有amiRNA存在,且植株的抗性与amiRNA的表达量成正相关。对T2代的转基因植株的抗病性分析结果发现,所有的抗性转基因植株的后代都表现高的抗病率,表明由amiRNA介导的PVY抗性在T2代植株中能够稳定遗传。