水稻OsVDAC3的功能分析及互作蛋白的筛选

来源 :中南民族大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xy_lfr
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电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)蛋白是线粒体外膜孔状蛋白,具有多种重要的生理生化功能。本实验室在水稻日本晴基因组中鉴定了8个osvdac基因,但多数的功能仍不清楚。  本文为了研究osvdac3功能,构建了水稻osvdac3植物RNA干涉载体,遗传转化得到阳性转基因植株;对已经得到的pCAMBIA1302-osvdac3超表达载体遗传转化的T1代植株进行非生物胁迫实验;另外,构建膜蛋白酵母双杂诱饵蛋白载体筛选水稻膜系统cDNA文库中与OsVDAC3相互作用的蛋白。综合分析,得到的主要结果如下:  1、根据osvdac3基因的ORF设计特异性干涉引物,将其克隆到植物干涉双元载体pMCG161中,构建了pMCG161-osvdac3干涉载体,以水稻日本晴为受体由农杆菌介导进行遗传转化。结果表明,通过检测引物PMCG3F/3R和PMCG2F/2R对转基因植株基因组DNA特异性扩增鉴定,得到了6株RNA干涉阳性转基因植株。RT-PCR结果表明,4株转基因阳性植株中osvdac3基因表达量是转基因阴性植株20-50%。  2、以转入植物超表达载体的T1代转基因植株幼苗为材料,RT-PCR检测超表达植株osvdac3基因的表达量,并对超表达阳性幼苗进行盐和甘露醇胁迫实验。结果显示超表达的osvdac3在盐胁迫中促进了根的伸长,在甘露醇胁迫中促进了苗和根的伸长,推测osvdac3能提高水稻对盐和干旱的双重抗性。  3、构建膜蛋白酵母双杂交诱饵蛋白载体pBT3-N-osvdac3ORF&pBT3-SUC-osvdac3 ORF,通过酵母双杂交实验,判断出osvdac3的N端位于细胞质内,C端位于细胞质外,因此确定pBT3-N-osvdac3ORF作为诱饵蛋白载体,并摸索得出3-AT浓度为7.5 mmol/L时严谨性最佳。以pBT3-N-osvdac3ORF筛选水稻YTB幼穗膜系统cDNA文库,以及菌落转移过滤染色实验,鉴定出了3个与OsVDAC3相互作用的阳性蛋白,分别为DNA结合蛋白S1FA、信号识别受体蛋白和核酮糖二磷酸羧化酶。
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