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目的 研究免疫调节剂CH1b、CH2b对健康人和活动期RA患者i NKT细胞体外增殖与功能的影响,对比CH1b、CH2b对两组i NKT细胞作用的差异;并探讨i NKT细胞对CH1b、CH2b可能的识别方式和细胞活化信号通路,为今后的临床应用提供理论依据。方法 ①观察免疫调节剂CH1b、CH2b体外对健康人和活动期RA患者i NKT细胞体外增殖与功能的影响。首先,收集健康人和活动期RA患者外周静脉抗凝血并分离单个核细胞(peripheral blood mononuclear,PBMC);其次,经α-半乳糖神经鞘胺醇(α-Galcer)和IL-2体外刺激扩增后,利用磁珠分选(MACS)技术分离扩增后PBMC得到纯化的恒定型自然杀伤细胞(i NKT细胞);再次,分别与免疫调节剂CH1b、CH2b共孵育后,采用MTT法定量检测各组i NKT细胞增殖率;MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine kit检测相应细胞培养上清中IFN-γ/IL-4的水平;RT-PCR检测各组i NKT细胞中IFN-γm RNA与IL-4 m RNA表达水平;MTT法检测各组i NKT细胞对K562细胞的杀伤活性。②探讨i NKT细胞对CH1b、CH2b可能的识别方式和细胞活化信号通路。首先,收集健康人外周静脉抗凝血并分离PBMC,经α-Galcer和IL-2体外刺激扩增后,利用MACS技术分离得到纯化的i NKT细胞;其次,分别与免疫调节剂CH1b、CH2b及相应CH的抗CD1d共孵育后,采用MTT法定量检测各组i NKT细胞增殖率;MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine kit检测相应细胞培养上清中IFN-γ/IL-4的水平;RT-PCR检测各组i NKT细胞中IFN-γm RNA与IL-4 m RNA表达水平;MTT法检测各组i NKT细胞对K562细胞的杀伤活性;再次,Western-Blot检测CH1组、CH2b组i NKT细胞中T-bet与GATA3表达水平,明确CH刺激i NKT细胞活化的分子机制。结果 1.两组样品中单独IL-2组、CH1b组、CH2b组及空白对照组增殖均不明显(P>0.05)。与相应的对照组相比,IL-2+α-Galcer组增值率均明显升高(P<0.05)。与相应IL-2+α-Galcer组相比,健康人与活动期RA患者IL-2+CH1b组、IL-2+CH2b组i NKT细胞增值率显著提高(P<0.05)。但RA患者各组增殖率均显著低于健康人的相应对照部分(P<0.05);与相应对照组相比,α-Galcer均能显著促进i NKT细胞IFN-γ的分泌,CH1b、CH2b能明显增加IL-4的分泌(P<0.05),降低IFN-γ/IL-4(P<0.05),而对IFN-γ分泌的影响未见显著性差异(P>0.05)。RA病人各组细胞因子含量虽低于相应健康人部分,但均明显高于对照组(P<0.05);与相应的对照组相比,健康人与活动期RA患者i NKT细胞α-Galcer组IFN-γm RNA表达均明显增高(P<0.05);CH1b组和CH2b组IL-4 m RNA的表达均明显增高(P<0.05)而IFN-γm RNA表达无显著性差异(P>0.05);CH1b、CH2b能显著促进健康人与活动期RA患者i NKT细胞对K562细胞的杀伤活性(P<0.05),但RA患者各组杀伤率均显著低于健康人的相应对照部分(P<0.05)。2.抗CD1d组i NKT细胞增殖率、IL-4分泌、IL-4 m RNA表达、杀伤活性均低于相应CH组,与对照组相比差异不明显。提示CD1d抗体抵消了CH1b、CH2b对IL-2刺激i NKT细胞增殖的促进作用、对IL-4分泌的促进作用、对IFN-γ/IL-4的下调作用、对IL-4 m RNA表达的上调作用和对i NKT细胞杀伤活性的促进作用;与对照组相比,CH1b组和CH2b组T-bet表达差异不明显而GATA3的表达明显增高。结论 1.CH1b、CH2b能促进健康人与活动期RA患者经IL-2活化的i NKT细胞体外增殖,活动期RA患者i NKT细胞存在增殖或活性低下;CH1b、CH2b能刺激健康人与RA患者i NKT细胞分泌具有明显Th2倾向的细胞因子,可能具有调节免疫紊乱和过度炎症反应的功效(CH2b更突出);CH1b、CH2b主要通过上调IL-4 m RNA的表达,影响i NKT细胞分泌的细胞因子,对调节活动期RA患者Th1/Th2失衡,抑制过度炎症反应具有重要意义(CH2b更为突出);此外,CHlb、CH2b能够显著增强i NKT细胞毒活性;活动期RA患者i NKT细胞存在功能缺陷。2.i NKT细胞对CH1b、CH2b的识别及功能活化可能与TCR-CD1d依赖途经相关;CH1b、CH2b有可能通过激活转录因子GATA-3通路调节i NKT分化方向,促进IL-4分泌形成TH2倾向,从而对RA个体进行定向免疫调节。因此,CH1b、CH2b是极具应用潜能的i NKT细胞激动剂,有可能成为今后开发靶向i NKT细胞的RA免疫治疗的工具。