二氧化硫（SO₂）是一种常见的大气污染物。大气中低浓度的SO₂能促进植物生长,尤其是在土壤含硫不足时。但是,过量的SO₂会对植物产生毒害作用:导致植株叶片失绿、坏死;光合速率下降,呼吸作用增强;细胞内酶活性丧失;生长发育受到抑制,甚至死亡。植物受到逆境胁迫时,会通过调节自身生理状态积极适应周围环境,其中,基因转录调节发挥了重要作用。本实验室前期研究表明,SO₂胁迫诱发的基因转录应答与逆境生理中DNA胞嘧啶甲基化特征改变有关,同时也受microRNA（miRNA）分子的调节。miRNA是真核生物中广泛存在的一类长度约为21²3 nt的内源性非编码RNA,主要通过对靶mRNA的降解或翻译抑制等方式,在转录后水平调节基因表达,最终引起代谢与信号转导途径的变化实现对逆境的响应。植物miRNAs参与植物体的生长发育,以及各种生物与非生物胁迫响应过程。非生物胁迫如干旱、高盐、低温、营养亏缺等能诱导多种植物miRNA分子表达,但迄今为止,参与SO₂胁迫响应的植物miRNA及其调控机制尚不明确。SO₂另一个重要的功能是作为目前鲜食葡萄贮藏期间最有效的保鲜剂。对鲜食葡萄贮藏期间对照组和SO₂保鲜组果实mRNA表达谱的研究发现,SO₂保鲜组果实中抗氧化、耐受和防御相关基因的表达水平发生改变,生物信息学分析结果表明,其中一些差异表达基因受到miRNA的调控,因此,SO₂的保鲜效应可能与miRNA调控基因转录水平相关。但目前为止,分析鲜食葡萄贮藏期间miRNA转录特征及其与果实品质关系的研究很少,关于SO₂如何影响葡萄果实miRNA转录及其保鲜防腐机制的研究未见报道。本课题以模式植物拟南芥及本地产玫瑰香葡萄果实为实验材料,利用高通量测序、生物信息学分析技术,结合分子生物学、生理学等实验方法,分析SO₂对植物miRNA转录的影响及葡萄采后保鲜作用机制。结果如下:1.为了鉴定拟南芥中参与SO₂胁迫响应的miRNA,本研究利用Illumina Hiseq2000高通量测序技术检测了30 mg·m^-3SO₂熏气72 h后拟南芥地上组织miRNA转录组。从对照组和SO₂处理组中共鉴定到269个known miRNAs和51个novel miRNAs,其中SO₂熏气组与对照组相比,共有27个known miRNAs（1.5倍以上）和12个novel miRNAs发生差异表达。对这些差异表达miRNA预测到的的58个靶基因涉及16类生物学过程,11种细胞组分和6种分子功能;主要通过植物激素信号转导、次生代谢物合成等途径参与拟南芥对SO₂的胁迫应答。利用RT-PCR验证了生长素信号转导途径相关miRNAs前体序列及其靶基因的表达水平,结果表明SO₂诱导MIR160b和MIR393a的表达量增加,并与其对应的靶基因生长素响应因子ARF10/16/17（Auxin Response Factor10/16/17）和生长素受体TIR1（Transport Inhibitor Response 1）,F-box家族成员AFB2/3（Auxin Signaling F-Box 2/3）的转录水平呈负相关,证实了高通量测序结果的可靠性及拟南芥适应SO₂胁迫过程中生长素信号途径相关miRNAs的调控作用。2.生长素信号途径在植物抗病过程中发挥重要作用。为了探究拟南芥适应SO₂胁迫过程中对生物胁迫的响应及其作用机制。本研究对拟南芥进行30 mg·m^-3SO₂熏气72 h后接种灰葡萄孢（Botrytis.cinerea,B.cinerea）,发现SO₂熏气染菌组（SO₂+）中拟南芥叶片发病率和病情发展速度较对照染菌组（CK+）均显著降低。SO₂+组中防御相关酶包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）,多酚氧化酶（PPO）,β-1,3-葡聚糖酶（BGL）,几丁质酶（CHI）的活性及其对应编码基因PAL,PPO,PR2,PR3的转录水平均明显高于对照组（CK）,对照染菌组（CK+）和SO₂熏气组（SO₂）。同时,SO₂+组拟南芥中次生代谢产物木质素、类黄酮及总酚含量显著升高。另外,SO₂+组拟南芥中生长素信号途径相关MIR393a,MIR160b,MIR167a,MIR167c的表达水平较其他处理组均显著升高。同时,这些miRNAs与其对应靶基因TIR1,AFB2/3（miR393靶基因）;ARF10/16/17（miR160靶基因）;ARF6/8（miR167靶基因）的转录水平呈负相关。SO₂+组拟南芥中三个生长素响应基因GH3-like,BDL/IAA12及AXR3/IAA17的表达水平也被明显抑制。结果表明:30 mg·m^-3SO₂熏气72 h能够有效诱导拟南芥对灰霉菌抗病性增强。SO₂诱导拟南芥对灰霉菌抗性增强过程与次生代谢相关的抗病防御及miRNA调节的生长素信号途径抑制有关。3.为验证SO₂对鲜食葡萄的保鲜效应是否与miRNA的转录调节作用有关。本研究以本地产玫瑰香葡萄（Muscat Hamburg）果实为实验材料,运用Illumina Hiseq2500高通量测序技术,研究采后贮藏保鲜期间葡萄果实miRNA转录组。构建了葡萄果实四个贮藏时段（0 d,20 d,40 d,60 d）对照组（C）和SO₂保鲜组（T）中共7个样本的小RNA（small RNA,sRNA）文库（C0,C1,C2,C3,T1,T2,T3）,从7个文库中共鉴定到148个known miRNAs和49个novel miRNAs,其中SO₂保鲜组与对照组相比,共有61个miRNAs发生差异表达。这61个差异表达的miRNAs（DEMs）共预测到543个具有功能注释的靶基因。这些靶基因涉及17类生物学过程,15种细胞组分和11种分子功能。对靶基因的KEGG pathway注释分析发现,葡萄贮藏期间涉及靶基因数目较多的抗病相关pathways（ko01100,ko01110,ko00940,ko00941）均与次生代谢相关。贮藏期间,SO₂保鲜组中与可溶性糖代谢相关的6个miRNAs的表达水平总体高于对照组,这些miRNAs可能通过对其靶基因（蔗糖合成酶与己糖激酶）的负调控作用,抑制可溶性糖的分解,以维持葡萄果实良好的口感。利用RT（poly A加尾法）-qPCR及Pearson相关性分析验证了在不同贮藏时期均发生差异表达的7个miRNAs及它们对应靶基因的表达模式,结果表明,7个miRNAs与其对应靶基因的表达水平呈负相关,证实了miRNAs对靶基因的调节作用。鉴定的7对miRNA-靶基因参与葡萄贮藏期间包括果实软化,衰老,乙烯合成,次生代谢等过程,说明SO₂诱导miRNA转录,对延缓葡萄果实生理衰老和抵御病原菌感染具有积极作用。4.以不同品种的葡萄（玫瑰香和红提）为实验材料,研究保鲜剂SO₂在鲜食葡萄果实采后贮藏期间抵御病原菌感染的作用机制。研究发现:葡萄采后贮藏期间,SO₂能够降低葡萄果实表面的pH值,有效抑制灰霉菌的生长。在贮藏60天时,SO₂保鲜组中葡萄果实的好果率维持在95%左右,显著高于对照组。贮藏期间,SO₂保鲜组葡萄果皮中苯丙氨酸代谢途径关键酶PAL的活性升高。次生代谢产物总酚、类黄酮和木质素的含量在对照组和SO₂保鲜组中均有所提高,而SO₂处理组中各指标的增幅明显高于对照组。PPO活性在SO₂处理组和对照组中均降低,但SO₂组中PPO活性显著高于对照组。另外,SO₂处理组葡萄果皮中CHI和BGL活性及其编码基因chitinase3（CHI3）,CHI1b及PR2的表达水平均显著高于同期对照组。结果表明:鲜食葡萄采后贮藏期间,SO₂能够有效抑制病原菌的生长,增强果实次生代谢途径,促进次生代谢产物积累,提高果实抗病防御能力,从而促进果实保鲜,延长采后贮藏期。综上所述:SO₂可诱导拟南芥地上组织和玫瑰香葡萄果实中多个防御相关的miRNAs发生转录响应,其靶基因功能主要涉及植物激素信号转导与次生代谢相关途径。一定浓度的SO₂能有效诱导拟南芥对灰霉菌抗病性增强。SO₂诱导拟南芥抗病性增强过程与次生代谢相关的抗病防御及miRNA调节的生长素信号途径抑制有关。鲜食葡萄采后贮藏期间,葡萄miRNA及其靶基因参与SO₂对果实的采后保鲜。SO₂能够抑制病原菌生长,增强次生代谢途径,提高果实抗病防御能力,维持果实品质,延长鲜食葡萄采后贮藏期。