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罗伯茨绿僵菌（Metarhizium robertsii）作为世界范围内广泛使用的生物害虫防治真菌,因具有安全、环境友好、易在害虫间流行和不易产生抗药性等优点,在害虫的生物防治中越来越受关注。然而,与其他虫生真菌杀虫剂一样,具有杀虫速度慢、保质期短以及防治效果不稳定等缺陷。因此,有必要对绿僵菌的生长发育、逆境应答和致病力进行深入研究,为绿僵菌能广泛应用于农林业提供理论依据。RNA的周转和代谢是基因表达的关键步骤,在调节高等真核生物的生长发育过程中起着至关重要的作用。RNA套索脱支酶（Dbr1,RNA lariat debranching enzyme）属于金属磷酸酯酶（MPE）家族,其作用是pre-mRNA剪接的过程中,特异性地水解内含子中的2’-5’磷酸二酯键,将套索形式的内含子转化为线性分子,进而在高等真核生物的生长发育、致病等过程中发挥重要的作用。截止目前,Dbr1在昆虫病原真菌包括绿僵菌中的作用还鲜有报道。本文以罗伯茨绿僵菌为研究对象,首先,针对RNA套索脱支酶基因（MrDbr1,MAA＿10593）进行序列分析;其次,使用农杆菌介导的同源重组的方法进行基因敲除,获得MrDbr1基因敲除菌株（ΔMrDbr1）和回补菌株（Comp）;最后,通过与野生型菌株（WT）进行多种生物学特性分析来阐明罗伯茨绿僵菌MrDbr1的生物学功能及可能的调控机制。主要研究结果如下:1.MrDbr1的系统发育分析在NCBI中搜索获得MrDbr1的全长序列,共编码543个氨基酸。保守功能域分析发现MrDbr1在C端含有一个DBR1保守结构域（第340至486位,Accession:pfam05011）,进一步的系统发育分析显示MrDbr1与蝗绿僵菌（Metarhizium acridum）亲缘性较高,通过BLAST同源性比较与MaDbr1相似性高达92.91%。2.MrDbr1敲除菌株和回补菌株的获得为了探究MrDbr1在罗伯茨绿僵菌中的生物学功能,基于同源重组的原理靶向敲除目的基因MrDbr1;首先根据MrDbr1所在绿僵菌基因组位置,通过选择该基因两端侧翼序列及全长序列,分别构建其敲除载体和回补载体;随后通过农杆菌介导的遗传转化的方法获得基因敲除和回补转化子;并进一步通过PCR和RT-PCR验证分析获得的阳性敲除/回补菌株。3.MrDbr1在绿僵菌生长发育中的作用分析为了分析MrDbr1基因在罗伯茨绿僵菌生长发育中的作用,对不同菌株（WT、ΔMrDbr1、Comp）进行生长发育分析,结果发现:与WT相比较,ΔMrDbr1在PDA培养基上菌落生长速率显著降低,进一步菌落营养生长分析,第14 dΔMrDbr1菌落生长直径在PDA、SDAY、1/4SDAY培养基上分别降低了39.10%、17.99%和30.22%;ΔMrDbr1萌发中时上升了28.67%;ΔMrDbr1产孢量在第14 d下降了97.59%。综上所述,MrDbr1对绿僵菌的生长发育发挥着关键作用。4.MrDbr1在绿僵菌逆境应答中的作用分析为了研究MrDbr1基因敲除对罗伯茨绿僵菌在逆境应答中的影响,对不同菌株（WT、ΔMrDbr1、Comp）进行不同逆境压力应答分析。将不同菌株孢悬液进行热处理（42℃和45℃水浴90 min）和紫外照射（UVP TL-2000紫外交联仪照射,具体设置Energy为1）处理,以及在含不同化学试剂（400μg/mL SDS、500μg/mL CR、0.5μl/mL H2O2、10μg/mL menadione和0.5 M Na Cl）的PDA培养基上培养,其中,SDS和CR影响细胞壁完整性、H2O2和menadione影响抗氧化性、Na Cl能够形成高渗环境。结果发现:与WT相比较,42℃热处理下,ΔMrDbr1的相对萌发率在16 h和24 h分别下降了63.62%和10.74%;45℃热处理下,ΔMrDbr1的相对萌发率在16 h和24 h分别下降了62.63%和18.80%;紫外照射处理下,ΔMrDbr1的相对萌发率在16 h和24 h分别下降了62.39%和11.17%;化学试剂胁迫下,ΔMrDbr1在SDS、CR、H2O2、menadione和Na Cl培养基上菌落抑制率分别下降了8.63%、9.53%、15.24%、4.70%和24.85%。综上所述,MrDbr1基因敲除导致罗伯茨绿僵菌对热耐受能力下降;对紫外耐受能力下降;对影响细胞壁完整性因子的耐受力增强,参与调节抗氧化反应,对高渗环境有显著的耐受力。5.MrDbr1在绿僵菌致病力中的作用及可能机制分析为了探究MrDbr1基因是否参与调节罗伯茨绿僵菌的致病力,对不同菌株（WT、ΔMrDbr1、Comp）的致病力进行分析。结果发现:以大蜡螟为试虫的体壁侵染和直接注射的毒力分析显示ΔMrDbr1的毒力显著降低,在体壁侵染实验中,ΔMrDbr1的LT50（11.36 d）显著长于WT（4.23 d）和Comp（4.54 d）;直接注射实验中,ΔMrDbr1的LT50（68.35 h）也显著长于WT（56.24 h）和Comp（54.98 h）。为了进一步探析MrDbr1基因是否参与调控绿僵菌致病机制,对不同菌株的附着胞形成率、角质层穿透能力以及脂质的运输进行测定,研究发现:与WT相比较,ΔMrDbr1的附着胞形成率在疏水皿和蝉翅上均显著下降,分别下降了63.50%和57.57%;角质层穿透实验表明ΔMrDbr1穿透能力显著降低;脂质运输的实验显示ΔMrDbr1的脂质运输显著减缓并在附着胞内逐渐积累。综上所述,MrDbr1在绿僵菌的生长发育、逆境应答及致病力中均发挥重要的作用。