家族型淀粉样多神经病（Familial amyloidotic polyneuropathy，FAP）是一种罕见的常染色体显性遗传病，与阿尔茨海默病，帕金森病等同属于淀粉样蛋白沉积疾病。临床表现为在全身组织间隙中出现淀粉样物质沉着，早期主要损伤末梢神经和植物神经，晚期可累及许多内脏器官。一般患者在症状出现后的几年到十几年内死亡。因此，FAP属于严重的致死性遗传病。葡萄牙，瑞典和日本是FAP的多发国，我国只有十几个FAP散在病例和家系的报道。转甲状腺素蛋白（Transthyretin，TTR）基因的点突变与FAP疾病密切相关。FAP患者往往可以检测到该基因某个位点的突变。目前100余种TTR基因点突变陆续被发现，其中多数与FAP发生有关，以V30M最常见。人TTR基因位于18q12.1，包含4个外显子，编译127个氨基酸组成的蛋白单体。在正常生理环境下，未发生突变的TTR结构稳定，以同源四聚体的形式在血浆中存在，其主要作用是运输甲状腺素和维生素A。TTR基因点突变往往使四聚体结构稳定性下降，解离为单体，再聚合为低聚体，最后形成淀粉样物质沉积。目前认为TTR蛋白的稳定性下降是导致该淀粉样物质形成的主要原因。其中TTR突变的位置和置换氨基酸的性质影响TTR蛋白稳定性。此外，突变体蛋白的解离速率也制约淀粉样物质的形成，TTR蛋白的四聚体解离速率和单体去折叠速率是淀粉样物质形成的限速步骤。因此，结构稳定性和解离速率共同决定TTR蛋白淀粉样物质的产生，直接影响FAP疾病的严重程度和发病进程。2009年8月吉林大学第一附属医院发现了一个五代FAP家系，已收集包括先证者及两名患者在内的38份家族血液样品。TTR编码区测序结果表明3名FAP患者均为V30A TTR杂合携带者，未患病者无此突变；组化分析的结果表明在FAP先证者的外周神经等处沉积了大量的TTR阳性纤维样物质；临床症状表明TTR沉积部位出现了相应器官功能的异常和减退，其中包括四肢末端感知觉差等自主神经受损症状，躯干及四肢肌肉萎缩等骨骼肌功能减退症状等。因此，我们确定这个五代的FAP家族的致病原因可能与TTR的V30A突变有直接关系。TTR V30A属于少见并且散在的突变位点，于1992年在一个FAP德裔家族被首次发现，以后很少有报道。我国研究人员于2003年和2007年分别报道了一名携带TTR V30A的FAP患者和家系。这些报道仅关注FAP患者的临床症状和遗传特征，而关于V30A突变如何引起TTR结构改变、导致淀粉样蛋白的沉积和相应病理症状则未见报道。本论文拟通过研究重组野生型，V30A和V30M TTR蛋白的结构稳定性和解离动力学特征，揭示V30A突变对淀粉样沉淀形成和神经细胞毒性的影响，以此探明此家系的致病因素。首先我们建立了野生型TTR，V30A和V30M突变体的体外重组表达体系。将TTR基因序列改造为大肠杆菌偏好的密码子，通过pQE30-M15体系表达TTR蛋白。pQE30质粒的N端带有6个组氨酸标签，可直接通过镍柱亲和层析纯化蛋白。结果表明每100ml的M15菌液能产生大约4mg纯化的TTR蛋白，经非还原的SDS-PAGE电泳鉴定这些蛋白在pH7.4条件下均为四聚体结构。接下来，我们对野生型TTR、V30A和V30M突变体进行了体外稳定性的研究。首先通过OD400nm光密度分析和硫磺素（Thioflavin，ThT）荧光检测法分析突变对TTR淀粉样物质形成能力的影响，结果表明在pH压力下，V30A和V30M突变明显促进淀粉样沉淀的产生，其中以V30A的作用最为明显。时间动力学曲线的结果表明在pH4.2的条件下，V30A形成淀粉样沉淀的T1/2最短，即形成淀粉样沉淀的速度最快。然后我们观察了TTR的两个配体甲状腺素（Thyroxine，T4）和氟灭酸(Flufenamic acid，Flu）对不同TTR形成淀粉样沉淀的影响，结果发现两个突变体降低了T4和Flu对TTR淀粉样沉淀的稳定作用，表现为显著增加的半数抑制率（IC50值），尤其是T4抑制V30A突变TTR蛋白淀粉样物质形成的IC50值与野生型比较有统计学差异。这一结果与用等温微量热滴定法直接观察到的两个突变体降低Flu与TTR蛋白的亲和力相一致，表明V30A和V30M突变降低TTR与不同配体的结合能力。我们进一步详细地比较分析了野生型TTR和两个突变体的四级结构，三级结构和二级结构的热动力学和时间动力学稳定性。通过SDS-PAGE和白藜芦醇荧光法检测TTR的四级结构，我们发现在pH或尿素压力下，V30A和V30M突变促进四聚体解离为二聚体和单体；通过Trp荧光法检测TTR三级结构，发现在尿素梯度压力下，V30A最先打开折叠，暴露分子内部色氨酸残基；通过圆二色谱法检测TTR的二级结构，发现在尿素梯度压力下，V30A最先改变其β片层的结构。四级，三级和二级结构的时间动力学实验结果均表明V30ATTR的T1/2值最低，表明V30A突变加快TTR四聚体的解离和单体折叠的打开。V30M结果与前人报道相接近。分子动力学模拟的结果显示V30A的亲水表面面积和回旋半径明显高于野生型和V30M，表明突变导致TTR整体结构更加松散，稳定性下降。此外，由于该FAP家系患者均为V30A杂合携带者，为了模拟V30ATTR在人体的生理环境，我们也比较观察了野生型-V30A（1:1混合）的四级和三级结构稳定性，数据显示其稳定性高于V30A，但低于野生型。因此，一系列的研究均显示V30A突变导致TTR蛋白四聚体的稳定性明显下降，促进四聚体解离和单体打开折叠，聚合形成淀粉样沉淀。进一步，我们想知道TTR V30A突变体的稳定性下降是否与其神经毒性相关。首先通过MTT法和台盼蓝染色法观察了不同TTR对神经母细胞瘤IMR-32细胞的杀伤作用，研究结果显示V30A突变体对IMR-32细胞的杀伤作用明显高于野生型TTR，说明V30A稳定性下降导致更多的低聚物或淀粉样物质的产生可能是增加其细胞毒作用的原因。为了分析V30A的细胞毒作用机制，我们测定了细胞内的活性氧水平，发现V30ATTR处理的细胞，活性氧水平明显提高。Westernblot结果显示V30A突变体增加DNA损伤标记蛋白γH2AX的表达，凋亡标记蛋白Caspase3和PARP的裂解，及自噬标记蛋白Beclin1和热休克蛋白HSP70的表达。说明V30ATTR增强细胞的氧化压力，促进DNA损伤，诱导细胞凋亡和自噬。但关于自噬对细胞毒性的影响还需要进一步深入地探讨。综上所述，我们的研究结果显示，V30A突变使TTR的四级，三级和二级结构的稳定性明显下降，从而促进淀粉样物质的形成，增加对神经细胞的杀伤作用，其中伴随着细胞内活性氧水平的增加，DNA损伤，细胞凋亡和自噬。V30ATTR结构的不稳定性和潜在的神经细胞毒可能是导致此FAP家系致病的主要原因。