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研究背景:尼古丁作为香烟中最主要的成瘾和毒性成分,在吸烟引起的免疫系统损伤和相关疾病中发挥着关键和主导作用。本室前期研究显示,孕期尼古丁暴露可促进胎胸腺细胞及CD4单阳性(CD4 single positive,CD4SP)细胞凋亡,引起CD4+初始T细胞输出减少,进而导致子代免疫功能紊乱,其中Fas通路发挥重要的促凋亡作用,但具体的分子机制还不清楚。有研究证明,尼古丁可调控胎组织基因的DNA甲基化水平,且Fas表达可受DNA甲基化的调控。因此我们推测,尼古丁可能通过调控Fas的DNA甲基化修饰促进胸腺细胞凋亡。目的:观察尼古丁对胸腺细胞凋亡的影响,并从DNA甲基化修饰角度,探讨Fas凋亡通路介导的尼古丁促胸腺细胞凋亡的分子机制。方法:(1)胸腺细胞凋亡及Fas通路基因表达:选取出生后3周断奶ICR健康小鼠,无菌环境下建立原代胸腺细胞培养体系,分成正常对照组和尼古丁不同剂量(25、50、100、200 和 400 μM)组,给药 48 h,Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞活力。选取合适的尼古丁剂量(25、50和100 μM)给药48h,流式细胞术(Fluorescence Activating Cell Sorter,FACS)检测总胸腺细胞及CD4SP细胞凋亡水平的变化;根据尼古丁量效结果,选取50 μM尼古丁分别处理胸腺细胞0、24、48、72 h,FACS检测总胸腺细胞及CD4SP细胞凋亡水平的变化。实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)检测胸腺细胞α7 nAChR和Fas凋亡通路相关基因(Fas、Caspase 8、Caspase 3)的mRNA表达,FACS检测胸腺细胞膜表面的Fas蛋白表达,Caspase酶活性检测试剂盒测定Caspase 8和Caspase 3的活性蛋白水平。(2)Fas甲基化及甲基化酶参与尼古丁促胸腺细胞凋亡:首先,根据尼古丁对胸腺细胞的量效和时效作用结果,选择50 μM作为尼古丁给药剂量和48 h作为尼古丁给药时间,分子量阵列技术(SequenomMassARRAY)检测Fas启动子区的DNA甲基化水平,qPCR检测甲基化酶(TET1、TET2、TET3、Dnmt 1、Dnmt 3a、Dnmt 3b)的mRNA表达。然后选取表达显著改变的基因TET2进行siRNA干扰,Western blot检测TET2的蛋白表达,FACS检测总胸腺细胞及CD4SP细胞的凋亡比例及细胞膜表面的Fas蛋白表达,Sequenom MassARRAY检测Fas启动子区的DNA甲基化水平。(3)研究α7nAChR在尼古丁诱导的胸腺细胞凋亡中的作用:尼古丁处理前1小时给予尼古丁受体特异性抑制剂α-银环蛇毒素(α-Bungarotoxin,α-Btx)1 μg/mL或PBS处理,FACS检测总胸腺细胞及CD4SP细胞凋亡水平的变化和细胞膜表面的Fas蛋白表达,Caspase酶活性检测试剂盒测定Caspase 8和Caspase 3的活性蛋白水平,Western blot检测TET2的蛋白表达,Sequenom MassARRAY检测Fas启动子区的DNA甲基化水平。结果:(1)尼古丁促进胸腺细胞凋亡并激活α7 nAChR/Fas通路基因的表达:①细胞活性结果:25μM尼古丁对胸腺细胞活力没有显著影响,而50～200μM尼古丁呈剂量依赖性降低了胸腺细胞的活力(P<0.05,P<0.01)。②尼古丁量效与时效实验结果:尼古丁处理48h后,25 μM尼古丁对小鼠总胸腺细胞和CD4SP细胞的凋亡无明显影响,而50和100μM尼古丁显著增加了二者的凋亡比例;时效结果显示,尼古丁作用24h对胸腺细胞的凋亡无明显影响,随着尼古丁作用时间的延长,48～72h胸腺细胞的凋亡率呈时间依赖性显著增加(P<0.01)。③α7nAChR/Fas凋亡通路基因的表达:50和100μM尼古丁呈剂量依赖性增强了α7 nAChR、Fas、Caspase 8和Caspase 3的mRNA及蛋白或活性蛋白的表达。(2)Fas基因DNA甲基化及甲基化酶介导尼古丁促胸腺细胞凋亡:①Fas甲基化和甲基化酶表达的结果:尼古丁处理后,胸腺细胞Fas基因启动子区核酸(nuleotide,nt)-2394、nt-2441 及 nt+295 的甲基化水平显著降低(P<0.05),nt+456的甲基化水平也呈现降低趋势(P=0.06)。50和100μM尼古丁显著增加了 TET2的表达,各浓度尼古丁均对TET1、TET3、Dnmt 1、Dnmt 3a、Dnmt 3b的表达无明显影响。②siRNA瞬时转染结果:TET2表达降低后,尼古丁诱导的总胸腺细胞和CD4SP细胞凋亡效应、Fas去甲基化及Fas表达升高均被抑制。(3)α7nAChR介导Fas去甲基化及胸腺细胞凋亡:添加α-Btx后,尼古丁诱导的总胸腺细胞和CD4SP细胞凋亡、Caspase 8和Caspase 3活性蛋白及TET2蛋白表达、Fas去甲基化及蛋白表达升高均被抑制。结论:尼古丁可激活小鼠胸腺细胞膜表面的α7 nAChR,继而通过增强去甲基化蛋白TET2的表达降低Fas启动子的DNA甲基化水平,使Fas蛋白表达增加,Fas凋亡通路被激活,胸腺细胞凋亡增加。