研究背景和目的多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是浆细胞的恶性肿瘤,以浆细胞在骨髓中克隆性增殖导致骨骼损害,贫血,肾功能衰竭和免疫功能抑制为特征。MM是发病率位居第二的血液系统恶性肿瘤,中位发病年龄68岁。随着中国老龄化社会的进程,MM的发病率将会进一步提升。虽然针对骨髓微环境的新药如雷利度胺和硼替佐米显著改善了骨髓瘤治疗效果。但是,MM仍不能治愈,多数患者最终因出现复发或耐药而不治身亡。因此,亟待探索骨髓瘤的发病机制特别是关于骨髓微环境在骨髓瘤发生中的作用,为寻找新的治疗靶点提供理论依据。既往的研究发现骨髓瘤的发病不但与浆细胞的遗传学改变有关,骨髓微环境在其发生和耐药等方面也起到关键作用。骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMMSCs)是骨髓微环境的重要细胞成分,具有分化为脂肪细胞,成骨细胞和软骨细胞的能力。BMMSCs在MM病理生理中的作用是目前的一个研究热点。BMMSCs不但在骨髓瘤的耐药,生长和生存中发挥重要的作用,其功能紊乱还与骨髓瘤骨病密切相关。以往的研究发现骨髓瘤来源的BMMSCs(MM-BMMSCs)和正常供者来源的BMMSCs在功能和基因表达等方面存在明显的不同。例如,MM-BMMSCs支持骨髓瘤细胞增殖的能力增强,而其向成骨细胞分化和抑制T淋巴细胞的能力减弱;其在基因表达谱方面发生了改变,这些异常变化可能参与MM的发生发展。端粒是重复序列组成的DNA片段和相关蛋白质构成的染色体的末端,对染色体起到保护作用。端粒的缩短与老化和肿瘤相关。有报道提示端粒的损伤影响间充质干细胞的功能和基因表达。然而,MM-BMMSCs端粒长度的特点,端粒长度是否影响其基因表达,目前还未有研究见于报道。此外,对于MM-BMMSCs的生物学变化与骨髓瘤患者临床特征间的关系的研究也鲜有报道。由于研究人群,BMMSCs提取和培养体系等不同,既往关于MM-BMMSCs生物特征如成骨分化能力,衰老,免疫调节及基因表达等方面的论述中仍存在分歧。因此,有必要进一步研究MM-BMMSCs的生物学特征,为多发性骨髓瘤的发病机制提供理论依据,为其治疗提供新思路。本实验采用贴壁培养的方法获取骨髓瘤和对照组BMMSCs,通过细胞免疫表型和诱导分化鉴定间充质干细胞。比较两种细胞在免疫表型,基因表达,细胞周期和端粒长度方面的差异。研究骨髓瘤细胞条件培养液(MCCM)对MM-BMMSCs的生物学特征的调控作用。并分析MM-BMMSCs基因表达和端粒长度与患者临床特征间的关系。研究材料和方法骨髓间充质干细胞的培养和鉴定髂骨穿刺的方法抽取MM患者和对照组骨髓液,采用贴壁培养的方法获得原代间充质干细胞。通过免疫表型,细胞成骨分化培养和形态鉴定BMMSCs。比较MM和对照组BMMSCs形态特征和增殖能力。细胞周期采用流式细胞术的方法检测MM患者和对照组第四代BMMSCs的细胞周期。基因表达Real-time PCR方法测量白介素-6(Interleukin-6,IL-6),巨噬细胞炎性蛋白-1α(Macrophage inflammatory protein-1 alpha,MIP-1α),吲哚胺 2,3-二氧化酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO),Dickkopf-l(DKK1),核因子 kB受体活化因子配基(Receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand,RANKL),转化生长因子-β(Transforming growth factor-beta,TGF-β)和白介素-10(Interleukin-10,IL-10)基因在MM患者和对照组第四代BMMSCs中的表达。端粒长度Real-time PCR的方法检测12例MM患者和8例对照BMMSCs的端粒长度。选择3对年龄相仿的骨髓瘤患者和对照组BMMSCs,应用Flow-Fish方法测量BMMSCs端粒的长度。MCCM对MM-BMMSCs基因表达和细胞周期的影响选取3例MM-BMMSCs,Real-time PCR方法测量MCCM作用前后IL-6,MIP-1α和IDO基因的表达情况。流式细胞仪分析MCCM作用前后细胞周期的变化。研究结果原代MM-BMMSCs生长缓慢,形态无明显异常。传代后的骨髓瘤和对照组BMMSCs相比,在形态和增殖速度上未见差异。流式细胞分析表明MM-BMMSCs和对照间充质干细胞一样,表达CD73,CD90和CD105,不表达CD34,CD45和HLA-G。两者在成骨诱导培养液中,均具有向成骨细胞分化的能力。细胞周期分析发现骨髓瘤组与MM-BMMSCs相比更多处于G0/G1期,而对照组BMMSCs更多处于S期和G2/M期。与对照组BMMSCs相比,Real-time PCR发现MM-BMMSCs高表达IL-6和MIP-1α,低表达IDO。两者在DKK1,RANKL,TGF-β和IL-10的表达上未见明显差异。Real-time PCR方法发现MM-BMMSCs的端粒长度(0.98 ± 0.11)较对照组端粒长度(0.65 ± 0.07,P=0.03)明显延长。在年龄相仿的三组BMMSCs中,Flow-Fish 同样验证了 MM-BMMSCs比对照组BMMSCs具有更长的端粒长度。Real-time PCR未检测到hTERT在两者BMMSCs中的表达。在MCCM作用24小时后,MM-BMMSCs表达IL-6和MIP-1α增加,但是表达IDO明显减少。MCCM作用24小时后,处于G0/G1期的MM-BMMSCs增加,而位于S期的细胞明显减少。相关性分析发现,MM-BMMSCs的端粒长度与其表达的IL-6和MIP-1α成正相关。MM-BMMSCs表达基因IL-6和MIP-1α的水平与患者临床指标如性别,骨损,疾病分期,β2微球蛋白,骨髓中浆细胞比例和肌酐无相关性。虽然MM-BMMSCs端粒长度与疾病分期,β2微球蛋白,骨髓中浆细胞比例和肌酐无相关性,但是发生骨损的MM-BMMSCs比未发生骨损的MM-BMMSCs的端粒明显缩短。结论MM-BMMSCs与对照组相比具有相似的生长特征和免疫表型。MM-BMMSCs更多位于G0/G1期,其端粒长度较对照增加,且高表达IL-6和MIP-1α基因,低表达IDO基因。MCCM进一步诱导MM-BMMSCs处于G0/G1期,促进其表达IL-6和MIP-1α升高,而表达IDO降低,提示骨髓瘤细胞可能通过旁分泌的途径影响间充质干细胞的功能。相关性分析发现,MM-BMMSCs端粒长度与其表达的IL-6和MIP-1α呈正相关。MM-BMMSCs表达的IL-6和MIP-1α与患者临床指标无相关性,但是其端粒长度在发生骨损的MM-BMMSCs中较未发生骨损的MM-BMMSCs中明显缩短。我们的结果提示MM-BMMSCs可能参与了 MM的病理生理过程和骨髓瘤骨病的发生。