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近年来,在小麦中发现了专门抑制外源木聚糖酶作用的木聚糖酶抑制蛋白,已证实这些抑制蛋白在饲料工业等领域对施用的木聚糖酶的功效产生不利影响,因此找到能够对抑制蛋白活性显示出抗性的木聚糖酶显得尤为重要。本实验室前期已经获得黑曲霉p ET-20b-xyn X4在大肠杆菌中成功表达,经过测定抑制率为87.61%。本文通过构巢曲霉与XIP型抑制蛋白复合晶体结构得出22个相互作用位点,其中有五个关键的作用位点。同时将构巢曲霉与黑曲霉进行序列比对,得到22个作用位点。其中五个关键位点分别为A1、A2、A3、A4、A5,其余命名为1~17号;将不受XIP型抑制蛋白抑制的来自棘胞曲霉的木聚糖酶序列与黑曲霉序列进行比对得到B1、B2、B3;得到以上突变体后对酶活及抑制率进行测定,将正向突变体的结果综合分析后设计的10个突变体命名为18~28号。通过Quik Change Site-Directed Mutagenesis的方法,将其全部突变为中性、酸性或碱性氨基酸。将测序正确的突变菌株进行大量诱导表达,利用钴离子亲和层析得到纯酶后,将突变体与野生酶进行纯酶酶学性质的分析。结果表明:(1)A1、A2、A3、6号、13号、15号、16号、19号、20号、22号、25号突变体没有检测到木聚糖酶的活性。在等摩尔比条件下测定抑制率,A4和1号抑制率分别为75%和73.13%,较野生型XYN7下降了12.61%和14.48%。(2)野生型XYN7、1号、B1的最适p H为4.5,A4的最适p H为4.8,说明经过突变后1号比野生酶在耐酸性方面有所提高;野生型XYN7最适温度为45℃,A4和2号最适温度为50℃,B1的最适温度为40℃;A4、B1、1号、2号突变体的半衰期分别为19.553min、19.154min、36.517min、31.111min,而野生型XYN7的半衰期为130.304min,四个突变体酶较野生型XYN7相比半衰期大幅度下降,其稳定性较差。(3)经过酶促动力学分析,四个突变体酶的Vmax分别为0.006、0.002、0.002、0.003μmol·m L·s-1与野生型的0.018μmol·m L·s-1相比降低较为明显,说明突变体反应速率降低。四种突变酶的Km值分别为3.56、0.82、0.69、0.81mg·m L-1比野生酶的8.16 mg·m L-1低,说明突变体酶的底物亲和能力有所提高。而突变酶的Kcat值分别为2.88、1.21、0.91、1.29s-1相比野生酶的9.14降低较为明显,说明突变体酶的底物结合效率降低较为明显。本研究根据晶体结构及蛋白序列比对为依据,利用Quik Change Site-Directed Mutagenesis的方法获得具有抗性的突变体酶。从分子水平上探究了木聚糖酶与抑制蛋白之间的相互作用,为抗性木聚糖酶的筛选提供了理论依据。